I. GENOME CÂY KHOAI LANG

Khoai lang (Ipomoea batatas Lam.) là cây trồng lấy củ, thuộc họ Convolvulaceae, có nguồn gốc từ Trung Mỹ và Nam Mỹ, trải rộng toàn thế giới với đặc điểm là cây dễ trồng, hiệu quả năng suất trên đơn vị diện tích đất rất lớn so với những loài khác. Theo số liệu FAO năm 2017, Trung Quốc sản xuất khoai lang lớn nhất với 72 triệu tấn, theo sau đó là các quốc gia châu Phi, như Malawi (5,5 triệu tấn), Tanzania (4,2 triệu tấn), Nigeria (4,0 triệu tấn).

Bản chất di truyền của khoai lang là lục bội thể (2n = 6x = 90) (n=15); rất phức tạp để tiếp cận với lĩnh vực genomics. Nó là dị lục bội thể (allohexaploid species), genome AABBBB, dẫn xuất từ sự lai chéo giữa 2 loài: loài lưỡng bội AA với loài tứ bội BBBB, theo sau là hiện tượng doubling nhiễm sắc thể.

Giống khoai lang canh tác có 90 nhiễm sắc thể (2n=6X=90). Nguồn gốc của khoai lang vẫn còn đang được tranh cãi. Loài tổ tiên là Ipomoea trifda và Ipomoea triloba. Chi Ipomoea có khoảng 500–600 loài. Mười ba loài hoang dại có quan hệ di truyền gần với khoai lang canh tác được báo cáo. Ba loài của chi Ipomoea có khả năng là tổ tiên của khoai lang trồng, i.e., loài lưỡng bội I. triloba (A genome), loài lưỡng bội I. trifda (B genome), và loài tứ bội I. tabascana (B genome).

Kỹ thuật Pairedend (PE) reads được tích hợp bởi phần mềm SOAPdenovo2 r223 (Li et al. 2010), và đọc scafolding bằng mate pair (MP) reads nhờ phần mềm SSPACE2.0 (Boetzer et al. 2011). Kết quả tạo ra 77.400 scafolds với chiều dài tổng cộng là 513 Mb. Dòng 0431-1 tạo ra 181.194 khung mang gen, với chiều dài tổng cộng của dòng Mx23Hm là 712,2 Mb. Kích thước hệ gen của dòng Mx23Hm và dòng 0431-1 dựa trên kết quả phân tích k-mer frequency có giá trị tuần tự là 515,8 Mb và 539,9 Mb. Tổng chiều dài của những trình tự mang tính chất ứng cử viên cứng của các gen cần thiết  là  240 Mb (dòng Mx23Hm) và 353 Mb (dòng 0431-1). Số gen dự kiến có trong dòng Mx23Hm là 62.407 gen. Số gen dự kiến có trong dòng 0431-1 là 109.449 gen. Cho dù những  assembled sequences không hoàn toàn ở mức độ nhiễm sắc thể, nhưng chúng đã góp phần vào nghiên cứu di truyền khoai lang rất lớn như những genome tham chiếu đầu tiên (Shirasawa et al. 2017; Si et al. 2016; Zhang et al. 2017).

II. DINH DƯỠNG DỰ TRỮ Ở CỦ KHOAI

Củ khoai lang (storage roots of sweet potato), là bộ phận được thu hoạch, có giá trị kinh tế và giá trị dinh dưỡng, nguồn cung cấp rất giàu β-carotene, những sợi dễ tiêu hóa, flavonoids, tinh bột, và những chất dinh dưỡng thiết yếu khác cho con người.

Phân tích dựa trên công cụ di truyền bao gồm 724.438 chỉ thị SNP có độ tin cậy cao và 26.026 gen biểu hiện. Phân tích eQTL (expression quantitative trait locus) cho thấy có  4408 eQTLs điều tiết sự biểu hiện của 3646 gen, bao gồm 2261 eQTLs tại chổ (local) và 2147 eQTLs mang tính chất distant. Hai điểm nóng của distant eQTL được tìm thấy tại những gen đích làm giàu đáng kể sự phân chia chức năng chuyên biệt nhau. Kết hợp thông tin về phân tích mạng lưới điều tiết, eQTLs và bản đồ di truyền kiểu "association”, người ta thấy rằng  IbMYB1- 2 hoạt động như một regulator điều hành và nó là gen chủ lực có chức năng hoạt hóa sự sinh tổng hợp anthocyanin trong củ khoai lang. Đây là thông tin đầu tiên về kiến trúc di truyền của biến thiên trên toàn hệ gen của khoai lang.

Nó có thể được dùng để nghiên cứu ảnh hưởng của các biến thể di truyền đối với những tính trạng nông học chủ chốt của cây khoai lang.

eQTL mapping được tiến hành với 88 mẫu giống khoai lang. PCA hiển thị 92,3% biến thể di truyền biểu hiện ra, được giải thích bằng ba PC đầu tiên (principal components). Hai mẫu giống CRR022952 và CRR022965 có độ lệch chuẩn 2,5 so với giá trị trung bình, nên bị loại ra, còn lại 86 mẫu giống (n = 86) để thực hiện eQTL mapping.

Hình 1: Kết quả GWAS màu thịt củ khoai lang.

III. CHỐNG CHỊU STRESS PHI SINH HỌC

III-1. stress mặn: Yu et al. (2020) đã tiến hành dòng hóa gen IbPSS1, của hệ gen khoai lang (Ipomoea batatas (L.) Lam.). Sự thể hiện mạnh mẽ của gen IbPSS1 trong hệ thống này đã làm giảm đáng kể sự tích tụ ion Na⁺ trong tế bào rễ khoai lang. Kết quả này minh chứng vai trò quan trọng của IbPSS1 trong cải thiện tính chống chịu mặn của khoai lang chuyển gen. IbPSS1 điều khiển tính chống chịu mặn của khoai lang, được kiểm soát bởi phosphatidyl serine làm tăng cường sự truyền tín hiệu Ca²⁺ trong rễ.

Kết quả nghiên cứu di truyền biểu sinh được Yang et al. (2020) tiến hành kỹ thuật deep sequencing. Họ xác định được phân tử miRNA bảo thủ và phân tử miRNA mới phát sinh; khi cho cây khoai lang phơi nhiễm trong nghiệm thức xử lý mặn và nghiệm thức đối chứng. Tổng số 475 miRNAs được biết (thuộc 66 họ miRNA) và 175 miRNAs mới phát sinh được xác định.  

III-2. stress khô hạn: Arisha et al. (2020) đã tiến hành phân lập những gen có liên quan đến cơ chế chống chịu khô hạn của khoai lang nhờ tiếp cận với công nghệ NGS (next generation sequencing) và TGS (third-generation sequencing). Năm thư viện cDNA được hình thành từ sắc tố lá khoai lang khi cây còn non, với 30% dung dịch polyethylene glycol (PEG-6000) được xử lý trong vòng 0, 1, 6, 12, và 48 giờ đối với công nghệ SGS (second-generation sequencing). Mẫu lá được lấy ở lá thứ ba tính từ trên xuống sau khi cây non được xử 1, 6, 12, và 48 h dưới điều kiện stress khô hạn; để làm nên bộ thư viện phân tử cDNA phục vụ chạy TGS (third-generation sequencing). Tuy nhiên, mẫu lá của nhưng cây chưa xử lý khô hạn cũng được thu thập làm đối chứng. Tổng số chạy trình tự 184.259.679 kết quả “clean reads” trong SGS và TGS. Sau đó, người ta tổng hợp kết quả đọc trình tự lại thành 17.508 unigenes với độ dài phân tử trung bình là 1.783 bp. Trong số 17.508 unigenes ấy, có 642 (3,6%) unigenes không hề khớp với bất cứ phân tử DNA đồng dạng nào (any homologs) trong những cơ sở dữ liệu trước đó. Người ta có thể xem đây là những gen mới. Nghiên cứu transcriptome của một vài giống khoai lang chủ lực thông qua kỹ thuật de novo transcriptome assembly với việc sử dụng second và third-generation sequencing trên cơ sở Illumina là tiến bộ vượt bậc trong nghiên cứu di truyền khoai lang.

IV. CHỐNG CHỊU STRESS SINH HỌC

IV-1. sùng khoai lang: Sùng khoai lang có chu kỳ sống là hai tháng, khoảng 35 - 40 ngày trong những tháng mùa hè. Liao et al. (2020) tiến hành nghiên cứu di truyền tính kháng sùng đục củ khoai lang (sweet potato weevil; tên khoa học là Cylas formicarius). Đây là đối tượng gây hại rất nghiêm trọng cho canh tác khoai lang trên thế giới, làm củ khoai có vị đắng, có mùi hôi. Sùng khoai lang tạo nhiều vết thương liên tục sẽ kích thích cây tiết ra phytohormones, bao gồm jasmonic acid, salicylic acid, và abscisic acid. Những phytohormones ấy có thể điều tiết theo kiểu “up” các gen điều khiển chlorogenic acid, đó là gen IbPAL, IbC4H và IbHQT, giúp quản lý sùng khoai lang trên đồng ruộng.

IV-2. virus gây bệnh khoai lang: Jo et al. (2020) đã thực hiện một nghiên cứu về virome (hệ gen của siêu vi)  trên cây khoai lang thông qua sự tham chiếu của 10 thư viện khác nhau (libraries) từ tám vùng trồng khoai lang ở Hàn Quốc, hai giống khoai lang được phân tích RNA-Sequencing. Người ta xác định 10 loài siêu vi khác nhau xâm nhiễm cây khoai lang. Trong những loài siêu vi này, SPFMV  (sweet potato feathery mottle virus) chiếm ưu thế trội, theo sau đó là siêu vi SPVC (sweet potato virus C) và SPVE tại vùng trồng khoai lang Hàn Quốc. Người ta khảo sát 30 genomes của siêu vi thuộc tám loài virus. Mức độ đột biến di truyền cao nhất trong SPFMV, tiếp theo đó là SPVC và SPVG.

Bên cạnh đó, Badnaviruses SPPV của khoai lang đã được nghiên cứu bởi Kreuze et al. (2020). Siêu vi tấn công khoai lang thuộc chi Badnavirus được xác định là sweet potato pakakuy virus (SPPV). Họ đã giải trình tự đầy đủ của toàn hệ gen siêu vi SPPV với hai mẫu phân lập khác nhau. Kết quả cho thấy sự hiện diện của virus mang tính chất phổ biến khắp nơi trên toàn thế giới. Bệnh này lan truyền qua hạt giống và qua vết cắt.

V. CHỈNH SỬA GEN KHOAI LANG THEO HƯỚNG CẢI TIẾN PHẨM CHẤT TINH BỘT.

Chỉnh sửa gen thông qua hệ thống CRISPR/Cas9 là công cụ rất mạnh để cải biên di truyền của một số loài cây trồng trong đó có khoai lang. Wang et al. (2019) tiến hành đánh giá hiệu quả của hệ thống CRISPR/Cas9 đối với loài cây có củ, khoai lang (Ipomoea batatas), hai gen liên quan đến chu trình tổng hợp tinh bột: IbGBSSI (mã hóa men granule-bound starch synthase I), và IbSBEII (mã hóa men starch branching enzyme II), là đích đến để điều chỉnh; trong giống khoai lang giàu tinh bột Xushu22 và giống khoai lang giàu carotenoid là giống Taizhong 6. 

I. batatas được chuyển gen vào vector có thuật ngữ chuyên môn là “binary vector”, trong đó, gen Cas9 được chuyển vào promoter AtUBQ của cây Arabidopsis, phân tử gRNA được điều khiển bởi promoter AtU6 của Arabidopsis. Có tổng cộng 72 dòng Xushu 22 và 35 dòng Taizhong 6 chuyển gen, được tái sinh thành công và được phân tích đột biến có chủ đích. Hiệu quả đột biến có chủ đích đạt 62–92% với hình thức đột biến multi-allelic đối với cả hai giống thử nghiệm ấy. Hầu hết đột biến mang tính chất thay thế nucleotide (nucleotide substitutions) dẫn đến những thay đổi của trình tự amino acid,  những stop codons có tần suất thấp. Hơn nữa, những chèn đoạn ngắn nucleotide hoặc mất đoạn ngắn đều được tìm thấy trên cả gen IbGBSSI và IbSBEII. Có 2658 bp mất đoạn được tìm thấy trong dòng chuyển gen IbSBEII. Hàm lượng tinh bột tổng số không thay đổi có ý nghĩa trong dòng đột biến “knockout'’ gen IbGBSSI và IbSBEII so với dòng wild-type làm đối chứng. Tuy nhiên, khoai lang là cây dị đa bội (allopolyploid), nên knockout gen IbGBSSI làm giảm xuống, trong khi knockout gen IbSBEII tăng lên hàm lượng amylose trong củ khoai.  Kết quả chứng minh rằng công nghệ chỉnh sửa gen theo hệ thống CRISPR/Cas9 là công cụ rất hiệu quả để cải tiến phẩm chất tinh bột của củ khoai lang, và cải tiến giống cây có củ đa bội thể (Wang et al. 2019).

Chỉnh sửa gen qua hệ thống CRISPR/Cas9 là một cách mạng lớn trong sinh học cho phép nhà di truyền thao tác kỹ thuật loss hoặc gain of function của những gen đặc biệt nào đó để có tính trạng phẩm chất mong muốn của giống cây trồng (Jai et al. 2017; Yin et al. 2017). Kỹ thuật knockout với hệ thống CRISPR/Cas9 khá đơn giản với độ chính xác cao (Komor et al. 2016; Nishida et al. 2016).

Khoai lang (Ipomoea batatas) có chu trình sinh tổng hợp tinh bột yêu cầu phải hội đủ  năm lớp (class) enzyme căn bản (core enzymes), đó là ADP-glucose pyrophosphorylase (ADPG), starch synthases (SS), starch branching enzymes (SBEs), starch debranching enzymes (DBEs), và granule-bound starch synthase I (GBSSI), định vị tại chloroplast hoặc tại amyloplast (Tetlow 2006).

GBSSI có chức năng sinh tổng hợp amylose. SBEs bao gồm SBEI (starch branching enzyme I) và SBEII (starch branching enzyme II), có chức năng sinh tổng hợp amylopectin (James et al. 2003). Ức chế gen GBSS bởi đồng ức chế hoặc RNA can thiệp (RNAi) cho kết quả: sản sinh ra hàm lượng tinh bột không có amylose (Kihara et al. 2007).

Thành công gần đây của chuyển nạp gen, bản đồ gen của hệ gen khoai lang đã mở ra cánh cửa để nghiên cứu các chức năng của gen nhờ hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 (Wu et al. 2018).

GS BÙI CHÍ BỬU, IAS

(Trích dẫn từ 145 nguồn tài liệu tham khảo của PubMed, NCBI)