Hạt đậu tương là nguồn thực phẩm cho con người, thức ăn cho vật nuôi và làm nguyên liệu trong công nghiệp thực phẩm. Tuy nhiên, hàm lượng cao của nhóm đường họ raffinose (RFO) trong hạt đậu tương gây khó tiêu và giảm hiệu suất hấp thụ dinh dưỡng. Do vậy, các nghiên cứu nâng cao chất lượng hạt đậu tương thông qua giảm hàm lượng RFO đang được quan tâm trong những năm gần đây.

Sau 02 năm thực hiện, đề tài “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas9 trong tạo đột biến gen nhằm giảm tích lũy đường raffinose nâng cao chất lượng hạt cây đậu tương”, mã số VAST02.04/19-20 do PGS. TS. Phạm Bích Ngọc, Viện Công nghệ sinh học làm chủ nghiệm đã được nghiệm thu cấp cơ sở xếp loại Xuất sắc. Đề tài đã tạo ra các dòng đậu tương đột biến có hàm lượng RFO thấp hơn nhiều so với cây đối chứng, đồng thời hàm lượng đường dễ tiêu được tăng cao.

Trong nghiên cứu này, các nhà khoa học đã sử dụng hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 để gây đột biến nhóm gen mã hóa cho Galactinol synthase nhằm giảm hàm lượng đường khó tiêu họ raffinose (RFOs) trong hạt đậu tương. Các vector mang cấu trúc CRISPR/Cas9 được thiết kế và chuyển vào cây đậu tương thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Ở thế hệ T0 đã thu được các dòng đậu tương mang đột biến khác nhau. Các dòng triển vọng được tiếp tục gieo để thu được các dòng đột biến kỳ vọng của hai gen GmGOLS1A và GmGOLS1B ở thế hệ T1 và T2.

Hình 1A

Hình 1B

Hình 1A: Xác định đột biến định hướng thông qua giải trình tự gen quan tâm ở thế hệ T2. GmGOLS1A-WT, GmGOLS1B-WT: Trình tự gen mã hóa Galactinol synthase của cây đậu tương đối chứng; Hình 1B: Sự phân ly ở thế hệ T2 của dòng đậu tương đột biến D1.1; Phân tích được thực hiện trên gel agarose 2%

Kết quả các phân tích hóa sinh trên các hạt của dòng T2 mang đột biến được di truyền ổn định nhằm xác định hàm lượng đường trong hạt đậu tương cho thấy sự thay đổi rõ ràng trong thành phần hạt của các dòng đậu tương đột biến. Trong đó, tổng hàm lượng đường khó tiêu RFO (Raffinose Family Oligosaccharides) trong dòng đột biến đơn gen giảm 32% so với cây đối chứng, và trong dòng đột biến cả hai gen giảm 34,1% so với cây đối chứng (Hình 2A). Ngoài ra, mặc dù không có sự khác biệt về lượng stachyose  giữa dòng đột biến đơn gen và đột biến đồng thời hai gen nhưng so với hạt WT (Cây đậu tương đối chứng không mang đột biến) hàm lượng stachyose ở các dòng đột biến giảm tới 30%. Ở hạt T3, hàm lượng đường sucrose trong dòng đột biến đơn gen giảm 25,4% so với WT trong khi hàm lượng đường sucrose trong dòng đột biến đồng thời hai gen không có khác biệt đáng kể so với WT (Hình 2C). Tuy nhiên, khi tính toán tỷ lệ từng cacbohydrat trên tổng cacbohydrat hòa tan thì ghi nhận sự tăng tỷ lệ sucrose ở cả hai dòng đột biến đơn gen và đột biến đồng thời hai gen (Hình 2B).

Hình 2A

Hình 2B

Hình 2C

Thành phần các loại đường trong hạt của các dòng cây đậu tương. Hình 2A: Hàm lượng cacbohydrat tổng số và đường khó tiêu RFOs tổng số được đo bằng HPLC; Hình 2B: Tỷ lệ của stachyose và sucrose trên tổng lượng cacbohydrat hòa tan; Hình 2C: C: Hàm lượng các loại cacbohydrat trong hạt đậu tương; (DT26: Cây đậu tương đối chứng không mang đột biến - WT; D1.1.5-4, D1.1.7-1, D1.1.7-2, D1.1.14-3: Các hạt đậu tương đột biến T3)

Các thành phần khác, bao gồm độ ẩm, protein, chất béo, tinh bột trong hạt cũng được phân tích. Kết quả đo được cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về tỷ lệ tinh bột giữa các dòng đột biến và WT. Tuy nhiên, tỷ lệ protein và chất béo trong dòng đột biến đơn gen cao hơn (tương ứng là 40,06% và 21,9%) so với WT (tương ứng là 38,30% và 19,8%), trong khi đó, không ghi nhận sự thay đổi của các giá trị này đối với dòng đột biến đồng thời hai gen. Kết quả này chỉ ra rằng hai gen GmGOLS1A và GmGOLS1B không chỉ tham gia vào quá trình sinh tổng hợp RFO.

Hình 3A: Sinh trưởng của dòng đậu tương DT26 (WT) và các dòng đậu tương đột biến T2 (D1.1.5-4, D1.1.7-1, D1.1.7-2, D1.1.14-3) trong nhà lưới của Viện Công nghệ sinh học

Hình 3B: Đánh giá khả năng nảy mầm của các dòng đậu tương đột biến so với dòng WT

Hình 3C: Các chỉ số sinh trưởng, bao gồm số đốt, số nhánh, kích thước lá của các dòng đậu tương sinh trưởng trong nhà lưới

Bên cạnh đó, các nhà khoa học cũng đánh giá sinh trưởng và phát triển của các dòng đậu tương đột biến trong điều kiện nhà lưới. Kết quả thu được đã chứng minh các dòng đột biến có sự thay đổi về hàm lượng RFOs trong hạt sinh trưởng và phát triển bình thường, không có sự khác biệt so với cây đối chứng (Hình 3A và 3C). Ngoài ra, tỷ lệ nảy mầm của các hạt đậu tương T3 cũng được đánh giá. Kết quả so sánh cho thấy đột biến không làm ảnh hưởng đến sức nảy mầm của các hạt đậu tương (Hình 3B). Như vậy, về mặt hình thái và sinh trưởng, cây đậu tương đột biến không cho thấy sự khác biệt so với các cây đối chứng trong cùng điều kiện trồng trọt.

Kết quả của đề tài là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo về đường hướng sinh tổng hợp đường trong cây đậu tương cũng như một số cây trồng khác. Nghiên cứu cũng góp phần khẳng định vai trò cũng như sự tương tác giữa các gen liên quan tới enzym tham gia vào sinh tổng hợp đường trong hạt. Đây cũng là thành công đầu tiên về chỉnh sửa gen trên các giống đậu tương Việt Nam, mở ra tiềm năng ứng dụng trong cải tạo các giống đậu tương trong nước. Bên cạnh đó, việc sử dụng các giống đậu tương có hàm lượng đường khó tiêu thấp sẽ nâng cao sức khỏe người tiêu dùng, cải thiện hiệu quả trong sản xuất và chăn nuôi. Kết quả nghiên cứu của đề tài cũng đã được công bố trên Tạp chí quốc tế Frontiers in Plant Science: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2020.612942/full