Phương pháp mới dựa trên huỳnh quang để xác định các mục tiêu chỉnh sửa gen

Nicotiana benthamiana được sử dụng như là cây mô hình cho thử nghiệm này. Nguồn: Ben Hass.

Chỉnh sửa gen ở DNA thực vật có tiềm năng tạo ra các giống cây trồng có năng suất và khả năng chống chịu, nhưng tốn nhiều thời gian để đạt được những mục tiêu này. Để rút ngắn quá trình này, các nhà khoa học thường sử dụng các công cụ sàng lọc để xác định vị trí và phương pháp chỉnh sửa hệ gen thực vật để có thể đạt hiệu quả cao nhất.

 Các nhà nghiên cứu từ Đại học Illinois Urbana-Champaign đã mở rộng bộ công cụ phục vụ cho việc nghiên cứu các yếu tố điều hoà nhỏ gọi là khung đọc mở ngược dòng (uORFs). Phép thử biểu hiện tạm thời mới, một loại công cụ sàng lọc, được phát triển bởi các nhà nghiên cứu sử dụng các protein chỉ thị huỳnh quang liên kết với các uORF để phân tích nhanh chóng những thay đổi của các trình tự uORF ảnh hưởng đến sự điều hoà gen ở mức in vivo.

uORFs là các yếu tố trình tự DNA giúp điều hoà quá trình dịch mã RNA thông tin (mRNA) thành protein. Vì các uORF rất phổ biến trong hệ gen thực vật, chúng trở thành một mục tiêu đắc lực giúp các nhà nghiên cứu kiểm soát sự biểu hiện gen. Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng uORF thường giảm số lượng protein được tạo ra từ một phân tử mRNA. Khi các trình tự DNA của uORF được loại bỏ hoặc thay đổi bằng các phương pháp chỉnh sửa gen như CRISPR-Cas9, tác động ức chế này có thể bị loại bỏ, kết quả là gia tăng việc sản xuất protein từ các gen chuyên biệt.

Các phương pháp hiện tại để nghiên cứu uORFs thường gắn các yếu tố điều hoà này vào những gen - gọi là các gen chỉ thị, và chuyển chúng tạm thời vào cây mô hình hoặc các hệ thống tế bào chuyên biệt để đánh giá. Một chỉ thị phổ biến là luciferase, enzyme chịu trách nhiệm cho sự phát sáng của đom đóm, tạo ra những tín hiệu ánh sáng có thể đo lường được trong các phản ứng hoá học. Tuy nhiên, những phương pháp này thường yêu cầu thêm các bước chuẩn bị mẫu bổ sung và các hoá chất chuyên dụng, đặc biệt trong những hệ thống yêu cầu kỹ thuật thí nghiệm cao như protoplasts - tế bào thực vật đã được loại bỏ vách tế bào.

Phương pháp này được phát triển bởi nhóm nghiên cứu từ Illinois nhằm đơn giản hoá quá trình bằng cách sử dụng mô lá nguyên vẹn và các protein huỳnh quang, cho phép phân tích nhanh chóng sự điều hoà gen thông qua trung gian uORF đồng thời giảm thiểu việc xử lý mẫu và vật tư tiêu hao.

Sự phát triển của phương pháp này được dẫn dắt bởi Ben Haas, thuộc phòng thí nghiệm Stephen Long nằm trong dự án Hiện thực hóa việc gia tăng hiệu suất quang hợp (RIPE).

Haas cho biết: “Mục tiêu chính của dự án RIPE là kỹ thuật hóa quá trình quang hợp nhằm mang lại lợi ích cho nông nghiệp và các nông hộ nhỏ. Nhiều nhà nghiên cứu của dự án RIPE đang hướng tới việc điều hoà các sản phẩm gen trên con đường sinh học đó. Và chỉnh sửa gen có thể là một công cụ cực kỳ mạnh mẽ để đạt được những kết quả này trong nhiều loại cây trồng”.

Phương pháp này hoạt động bằng cách liên kết các uORF một cách tự nhiên hoặc đã qua chỉnh sửa với các protein chỉ thị huỳnh quang có khả năng phát ra các tín hiệu ánh sáng đo lường được trong các mô lá cây. Sau đó, các nhà nghiên cứu chuyển tạm thời các cấu trúc di truyền này vào lá nhờ sử dụng Agrobacterium, một loại vi khuẩn phổ biến được sử dụng trong công nghệ sinh học thực vật để chuyển DNA vào thực vật. Sau vài ngày, tín hiệu huỳnh quang có thể được đo lường bằng thiết bị phòng thí nghiệm tiêu chuẩn. Bằng cách so sánh cường độ huỳnh quang giữa các uORF tự nhiên và biến đổi, các nhà nghiên cứu có thể xác định liệu những thay đổi đối với các yếu tố điều hoà có làm thay đổi sự biểu hiện gen hay không.

Sơ đồ quy trình phân tích.

Mặc dù các protein huỳnh quang đã được sử dụng lâu dài như là các chất chỉ thị trong sinh học phân tử, ứng dụng của chúng cho nghiên cứu điều hoà biểu hiện gen qua trung gian uORF trên thực vật thì mới gần đây. Đánh giá huỳnh quang trực tiếp từ các mô lá nguyên vẹn tránh được phần lớn các bước chuẩn bị mẫu bổ sung vốn đòi hỏi nhiều cho các phân tích uORF hiện nay.

Bằng cách sử dụng phương pháp này, các nhà nghiên cứu đã phân tích các trình tự từ đậu nành và đậu trắng mắt đen – hai loại cây trồng trọng tâm của dự án RIPE. Các tác giả đã nhận định được các uORF của những gen liên quan đến cơ chế tự bảo vệ quang học ở thực vật và quan sát được sự thay đổi tương ứng của cường độ huỳnh quang.

Nhóm nghiên cứu hy vọng công cụ này sẽ hữu ích cho các nhà nghiên cứu khác và đã gửi các plasmid chỉ thị được mô tả trong nghiên cứu lên Addgene, nơi chúng được công khai đặt mua.

Haas cho biết: “Công cụ này có thể hữu ích đối với bất kỳ nhà nghiên cứu thực vật nào quan tâm đến việc đo lường hiệu suất dịch mã của vùng dẫn đầu bản mã; nó thực sự không chỉ giới hạn ở các uORFs. Các nhà nghiên cứu có thể đưa vào các trình tự riêng của họ và có được những kết quả đầu tiên chỉ trong vòng một tháng”

Trương Thị Tú Anh theo Dự án RIPE.