Công nghệ CRISPR định hướng bằng DNA gợi ý một hướng đi mới cho việc chỉnh sửa RNA.

Sự vươn mình của CRISPR, từ một hệ thống phòng vệ vi khuẩn ít được biết đến đã trở thành một công cụ phân tử mạnh mẽ luôn xoay quanh một thành phần nhỏ: RNA dẫn đường. Trong nhiều năm, RNA dẫn đường - được thiết kế, chỉnh sửa và tối ưu một cách tỉ mỉ trong vô số phòng thí nghiệm - đã được xem là một đặc điểm bất biến của hệ thống. CRISPR cắt tại vị trí mà RNA chỉ định. Đó là nguyên lý cốt lõi của hệ thống.

Nhưng một phương pháp tiếp cận mới cho thấy hệ thống này linh động hơn dự đoán. Nghiên cứu được công bố trên tạp chí Nature Biotechnology có tiêu đề: “CRISPR-Cas12 định hướng bằng DNA để nhắm mục tiêu RNA trong tế bào”.

Các nhà nghiên cứu tại trường đại học Florida (University of Florida – UF) đã phát triển hệ thống CRISPR đầu tiên sử dụng DNA thay vì RNA để hướng dẫn enzyme Cas đến các RNA mục tiêu. Nền tảng này được gọi là ΨDNA, tái lập trình các enzyme nuclease Cas12 để nhận diện và tác động lên RNA bằng cách sử dụng một khung dẫn đường dựa trên DNA. Kết quả mang lại là một phương thức hoàn toàn mới để kiểm soát RNA bên trong tế bào — phương thức mà theo các tác giả là “mở rộng hệ thống Cas12 vượt ngoài phạm vi chỉnh sửa bộ gen và chẩn đoán để cho phép kiểm soát chính xác và có thể lập trình được các hệ thống phiên mã trong tế bào và các dấu ấn biểu sinh trên RNA của chúng”.

Khái niệm này bắt nguồn từ một sự khác biệt sinh học đơn giản. DNA lưu trữ các chỉ dẫn dài hạn của tế bào, còn RNA mang những bản sao đang hoạt động. “Các bản sao RNA này giống các bản sao của bản hướng dẫn gốc, và đôi khi những bản sao đó có lỗi”, Piyush Jain, Phó giáo sư, tiến sĩ kĩ thuật hóa học ở UF và là tác giả chính của nghiên cứu cho biết. Những sai sót trong các bản sao đang hoạt động này có thể dẫn đến bệnh tật và việc nhắm mục tiêu vào RNA mang đến một phương thức can thiệp mà không làm thay đổi bộ gen gốc. Nhưng các hệ thống CRISPR định hướng bằng RNA, chẳng hạn như Cas13, có thể chịu ảnh hưởng từ sự không ổn định và tác dụng ngoài mục tiêu. Jain nói rằng: “Các hệ thống CRISPR nhắm vào RNA hiện nay dựa trên RNA dẫn đường để tìm mục tiêu của nó. Mặc dù có hiệu quả, nhưng đôi khi chúng có thể ảnh hưởng đến các phân tử không mong muốn… Chúng cũng có thể tốn kém và ít ổn định hơn”.

ΨDNA có một cách tiếp cận khác. Nhóm nghiên cứu đã thiết kế một DNA dẫn đường mô phỏng khung crRNA theo hướng ngược lại, cho phép AsCas12a và Cas12i1 liên kết với RNA và kích hoạt quá trình cắt DNA sợi đơn. Như phần tóm tắt mô tả, “ΨDNA… cho phép nhắm mục tiêu RNA bằng nuclease Cas12 bao gồm phát hiện RNA virus viêm gan C chính xác 100% trong mẫu lâm sàng”. Trong các dòng tế bào người, ΨDNA đạt hiệu quả ức chế 70-95% các bản phiên mã RNA nội sinh, được thúc đẩy bởi các cơ chế như làm trì hoãn ribosome và điều động RNase H1.

Jain coi công trình này là một bước chuyển đổi mang tính khái niệm đối với CRISPR. Ông nói với GEN “Bước tiến có ý nghĩa nhất là chúng tôi thấy rằng CRISPR-Cas12 có thể tái lập trình để nhắm đến RNA bằng cách sử dụng DNA dẫn đường thay vì trình tự RNA. Đó thực sự là một bước chuyển đổi về mặt khái niệm trong lĩnh vực này”. Đến bây giờ, nhắm mục tiêu vào RNA chủ yếu dựa vào hệ thống RNA dẫn đường. ΨDNA chứng minh rằng các enzyme Cas12 vốn là công cụ chỉnh sửa DNA truyền thống đã có thể chuyển hướng sang nhắm mục tiêu vào RNA “trong khi vẫn duy trì tính đặc hiệu cao và cho phép thực hiện nhiều chức năng, bao gồm phát hiện RNA để phát triển các phương pháp chẩn đoán, ức chế nội bào, nhắm mục tiêu đa điểm, nhắm mục tiêu kép vào cả DNA và RNA, và các chiến lược kết hợp tác nhân để sửa đổi RNA và các chiến lược điều trị tiềm năng”.

Phát hiện này xuất phát từ một câu đố về cấu trúc. Việc chỉ đơn thuần thay thế các bazơ RNA bằng các bazơ DNA sẽ không có hiệu quả; các enzyme Cas12 được cho là phụ thuộc chặt chẽ vào khung RNA. Jain nói “Một số nhóm đã cố gắng để làm CRISPR/Cas sử dụng DNA dẫn đường. Nhưng chỉ chuyển đổi các bazơ RNA thành bazơ DNA sẽ  không hiệu quả”. Bước đột phá đến từ việc thiết kế đoạn 3’DNA giúp tái tạo khung crRNA. Sàng lọc đột biến cho thấy một cấu trúc vòng xoắn cần thiết cho hoạt động, và hiện tại, cấu trúc cryo-EM – được giải mã với sự hợp tác của nhóm David Taylor tại UT Austin cho thấy rằng AsCas12a có nhiều cấu trúc linh động hơn mong đợi, cho phép nó thích ứng với một DNA dẫn đường gắn với RNA mục tiêu.

Điều làm cho nhóm bất ngờ nhất là hệ thống này tỏ ra vô cùng mạnh mẽ. Jain nói rằng: “Điều đặc biệt thú vị ở đây không chỉ là một hiện tượng kỳ lạ trong phòng thí nghiệm.” ΨDNA đã được ứng dụng trong phát hiện RNA lâm sàng, đạt độ chính xác 100% trên mẫu virus viêm gan C, và hoạt động bên trong tế bào với tác dụng phụ ngoài mục tiêu thấp hơn so với Cas13d.

Tính linh hoạt của nền tảng này có lẽ là đặc tính mạnh mẽ nhất của nó. ΨDNA có thể kết hợp với Rnase H1 để phân hủy RNA đích hoặc đến METTL3 để chỉnh sửa biểu sinh RNA. Và do crRNA và ΨDNA có thể chuyển giao đồng thời, chỉ một enzyme Cas12a có thể hoạt động ở hai chế độ cùng một lúc. Jain nói rằng: “Một tác nhân Cas12a duy nhất có thể đồng thời chỉnh sửa DNA và điều hòa RNA. Công trình này bắt đầu làm mờ ranh giới đó”.

Nhìn về phía trước, nhóm nghiên cứu đang mở rộng cả khía cạnh cơ chế và ứng dụng của nền tảng này. Họ đang tinh chỉnh các quy tắc trong thiết kế chỉ dẫn, phân tích cách ΨDNA dẫn dắt Cas12 kích hoạt quá trình ức chế biểu hiện gen và khám phá các ứng dụng trong chẩn đoán, điều hòa RNA đa mục tiêu, và ứng dụng điều trị ex vivo. Một hướng đi mới nổi lên là sử dụng công nghệ này để sửa chữa các cơ quan hiến tặng trước khi cấy ghép.

Nhìn rộng hơn, DNA dẫn đường mang lại những lợi thế thiết thực. Chúng dễ tổng hợp hơn, ổn định hơn và có tiềm năng mở rộng quy mô hơn so với RNA dẫn đường. Sự kết hợp đó có thể biến ΨDNA thành một nền tảng đa năng cho nghiên cứu cơ bản, chẩn đoán, và công nghệ trị liệu tương lai.

Sau nhiều thập kỉ nghiên cứu CRISPR dựa trên các hệ thống được dẫn dắt bởi RNA, ΨDNA giới thiệu một cách thức mới để điều khiển một trong những công cụ mạnh mẽ nhất của sinh học. Như Jain đã nói “Về bản chất, điều này giúp chúng ta kiểm soát tốt hơn – không chỉ viết lại hướng dẫn sử dụng mà còn quản lý chính xác cách thức sử dụng những hướng dẫn đó”.

Ngô Thị Phương Trinh - Hcmbiotech, theo Genengnews.