Thành tựu di truyền tính kháng rầy nâu của cây lúa và gen mới BPH35
Rầy nâu (BPH, Nilaparvata lugens Stål) gây thiệt hại nghiêm trọng cho canh tác lúa trên toàn thế giới, đặc biệt ở Việt Nam và châu Á. Rầy nâu chích hút nhựa cây gây hiện tượng cháy rầy, cây lúa bị khô và chết. Rầy nâu còn có khả năng truyền bệnh siêu vi như vàng lún, lùn xoắn lá; lúa cỏ. Rầy nâu có khả di chuyển rất xa trong tầng khí quyển. Người ta ước tính thiệt hại do rầy nâu trên sản xuất lúa khoảng 300 triệu USD mỗi năm.
Quản lý rầy nâu bằng hóa chất (thuốc trừ sâu) là biện pháp khá phổ biến, nhưng có quá nhiều rủi ro. Khai thác tính kháng của cây lúa trên nền tảng di truyền học là cách tiếp cận được sự đồng ý cao nhất của các nhà chọn giống, nhà môi sinh học và nông dân trồng lúa.
Nhiều thập niên quan, người ta đã phân lập được 39 gen kháng rầy nâu trong loại hình giống lúa trồng indica, loải hình giống lúa trồng châu Phi (O. glaberrima) và còn tìm thấy từ nhiều nguồn vật liệu lúa hoang. Trong số đó, có 34 gen được lập bản đồ di truyền trên nhiễm sắc thể 1, 3, 4, 6, 11 và 12.
Các gen gần đây đã được công bố trên tạp chí quốc tế là: Bph30, Bph31, Bph33, Bph33(t) và Bph34 (Jing et al, 2017; Prahalada et al, 2017; Hu et al, 2018; Kumar et al, 2018; Naik et al, 2018; Wang et al, 2018).
Còn 5 gen chưa xác định chắc chắn nhiễm sắc thể mà chúng định vị là bph5, bph8, Bph22(t), Bph23(t) và bph24(t) (Khush et al, 1985; Nemoto et al, 1989; Deen et al, 2010; Ram et al, 2010).
Tám gen Bph17/Bph3 (Liu et al, 2015), Bph6 (Guo et al, 2018), Bph9 (Zhao et al, 2016), Bph14 (Du et al, 2009), Bph18 (Ji et al, 2016), Bph26 (Tamura et al, 2014), Bph29 (Wang et al, 2015) và Bph32 (Ren et al, 2016) được dòng hóa (cloned).
Các gen Bph1, Bph2, Bph7, Bph9, Bph10, Bph18, Bph21 và Bph26 được xác định là đa alen, định vị trên cùng một locus trên nhiễm sắc thể 12 (Zhao et al, 2016).
Nguồn vật liệu cho gen kháng rầy nâu từ lúa hoang được xem như nguồn di truyền rất có giá trị cho chương trình cải tiến giống lúa. Cho đến này, người ta đã phân lập được khoảng 19 gen kháng: Bph10, Bph18, bph11, bph12, Bph13(t), Bph14, Bph15, Bph20(t), Bph21(t), Bph23(t), bph20(t), bph21(t), bph22(t), bph23(t), bph24(t), Bph27, Bph12(t), Bph13(t) và Bph34. Chúng có nguồn gốc từ 7 loài lúa hoang: O. australiensis, O. officinalis, O. minuta, O. rufipogon, O. latifolia, O. eichingeri và O. nivara) (Ishii et al, 1994; Liu et al, 2001; Renganayaki et al, 2002; Yang et al, 2002; Jena et al, 2006; Du et al, 2009; Rahman et al, 2009; Deen et al; 2010; Ram et al, 2010; Hou et al, 2011; Yang et al, 2012; Huang et al, 2013; Lv et al, 2014; Kumar et al, 2018; Jiang et al, 2019).
Zhang và ctv. (2020) đã phát triển ba dòng lúa dẫn xuất từ lúa hoang O. rufipogon có tên là RBPH54, W2183 và RBPH660. Ba gen kháng rầy nâu bph20(t)/Bph29, bph21(t) và Bph27 đã được phân lập trong dòng lúa RBPH54 và W2183 (Yang et al, 2012; Huang et al, 2013; Wang et al, 2015), theo thứ tự. Trong đó, gen Bph29 được dòng hóa, gen này mã hóa protein B3 domain kháng rầy (Wang et al, 2015). Gen kháng rầy nâu hoặc QTL điều khiển tính kháng rầy nâu trong dòng lúa RBPH660 cho đến nay vẫn chưa được khai thác đầy đủ. Người ta muốn xác định các vùng trong hệ gen cây lúa gắn với gen điều khiển tính kháng rầy nâu, trong dòng lúa dẫn xuất từ lúa hoang RBPH660, thông qua kỹ thuật phân tích BSA (bulked segregant analysis-seq). Sau đó, người ta thu hẹp lại vùng giả định này thành vùng mang gen ứng cử viên nhờ kết quả phân tích liên kết và kết quả “gene mapping”.
Phát hiện này sẽ vô cùng có ích cho kỹ thuật dòng hóa gen đích và sử dụng gen kháng rầy nâu trong cải tiến giống lúa.
Dòng lúa dẫn xuất từ lúa hoang O. rufipogon là RBPH660, thuộc loại hình lúa trồng indica có gen kháng BPH ổn định, nó được sử dụng để lập bản đồ di truyền gen kháng/QTL điều khiển tính kháng.
Giống lúa cao sản 9311, rất nhiễm rầy nâu được chọn làm mẹ để lai với RBPH660.
Người ta sử dụng 302 dòng F2:3 từ tổ hợp lai 9311 × RBPH660 để phân tích di truyền và đánh giá kiểu hình. Giống lúa Rathu Heenati (RH) là đối chúng kháng và Taichung Native 1 (TN1) là đối chứng nhiễm trong thanh lọc rầy nâu (trong nhà lưới và ngoài đồng).
Áp dụng phương pháp “standard seed-box screening” của Huang et al, (2001) và cho điểm theo tháng đánh giá Standard Evaluation System (SES) của IRRI (1996). Số liệu trung bình lấy từ 25 cây mạ quan sát.
Thực hiện chạy trình tự “Whole genome resequencing” và phân tích BSA-seq với tổng số 309 dòng con lai F2:3 của tổ hợp lai 9311 x RBPH660. Ba mươi cây kháng và 30 cây nhiễm được trồng dồn để xây dựng quần thể trồng dồn BPH-6R và BPH-6S. Mẫu DNA tách chiết phục vụ cho quy trình chạy “standard Illumina” / Thư viện DNA của IRRI, 1996 /nền chạy trình tự 239 Illumina Hi-Seq 2500.
Những “clean reads” được so sánh với trình tự tham chiếu của giống lúa Nipponbare, mã số IRGSP1.0, theo phần mềm BWA (Li và Durbin, 2009). Chỉ thị phân tử SNPs được phát hiện nhờ phần mềm GATK3.3 (McKenna et al, 2010), được chú thích di truyền bởi phần mềm ANNOVAR (Wang et al, 2010).
Ngoài phân tích liên kết di truyền, người ta còn phân tích “association” (di truyền phối hợp). Phương pháp SNP-index được tiếp cận, để xác định vùng gen ứng cử viên đối với những QTLs đích (Abe et al, 2012; Takagi et al, 2013). SNP-index là kết quả “short reads” tại chỉ thị SNPs khác với trình tự tham chiếu. Do vậy, SNP-indices của tập đoàn trồng dồn BPH-6R và BPH-6S là tỷ số giữa kết quả đọc số chỉ thị RBPH660 SNP trên số lần đọc tổng cộng ứng với chỉ thị SNPs của tập đoàn trồng dồn BPH-6R và BPH-6S. Khi SNP-index bằng 1.0 có nghĩa là tất cả số lần short reads phản ánh phân tử của hệ gen của dòng lúa kháng rầy RBPH660. Ngược lại, khi SNP-index bằng 0 có nghĩa là tất cả số lần short reads của giống nhiễm 9311. Tuy nhiên, muốn giảm ảnh hưởng sai số của sequencing hoặc so sánh trình tự, các vị trí của SNP với giá trị “read depth” phải nhỏ hơn 7× và SNP-index phải nhỏ hơn 0.
Giản đồ SNP-index của tập đoàn trồng dồn BPH-6R và BPH-6S xuất hiện các đốm trên 2 trục theo phép tính trung bình SNP-index của “sliding window” (kích thước window là 1 Mb, kích thước mỗi step là 1 kb) trên giản đồ biểu hiện. Giá trị SNP-index không khác hơn có ý nghĩa với 0 trong một vùng nào đó của genome, không mang QTL đích (Takagi et al, 2013).
Linkage analysis và gene mapping được tiến hành với chỉ thị SSR liên quan đến tính kháng rầy nâu, chỉ thị InDel tyrong các vùng chứa gen/QTL đích của genome, đặc biệt trên nhiễm sắc thể 4. Thanh lọc con lai có tính kháng BPH dựa trên đa hình của bố mẹ RBPH660 và 9311. SSR markers được sử dụng theo phần mềm Gramene database (http://archive.gramene.org/ markers/). Hai chỉ thị InDel (R4M13 và R4M30) được chọn của Shen et al (2004), những chỉ thị InDel khác được ký hiệu là ‘PSM’ được thiết kế nhờ phần mềm Primer 3.0 trên cơ sở chạy re-sequencing bố mẹ. Phân tích PCR theo quy trình của Chen et al (1997) có cải biên. Sản phẩm PCR từ kết quả chạy điện di trên gen polyacrylamide 7% và nhuộm bạc.
Genetic linkage map và QTL mapping được xử lý bằng phần mềm QTL IciMapping 4.1. Khoảng cách di truyền theo hàm Kosambi. Phân tích QTL được thực hiện theo module ICIM (inclusive composite interval mapping) có trong phần mềm QTL IciMapping 4.1 (Meng et al, 2015).
Người ta xác định QTL khi giá trị LOD (logarithm of odds) lớn hơn 2.5. Phân tích con lai phân ly F2, con lai tái tổ hợp dựa trên chỉ thọ phân tử liền kề trong vùng QTL mapping. Đánh giá khiểu gen bằng chỉ thị phân tử SSR và chỉ thị InDel mới được thiết kế để tim hiểu kiểu gen của các dòng recombinants, rồi tiến hành “narrow down” vùng gen ứng cử viên
Kiểu hình của giống kháng RBPH660 có thang điểm trung bình phản ứng với rầy nâu là 3.0, trong khi đó, giống 9311 là 9.0
Kiểu hình phản ứng rầy nâu của con lai F2:3 phân bố chuẩn, có một đỉnh, cho thấy tính kháng của giống RBPH660 được điều khiển bởi nhiều gen chủ lực (QTLS) hoặc/và gen thứ yếu. Xác định loci chủ lực điều khiển tính kháng bằng resequencing và BSA-seq. Tổng số reads là 113.04 triệu lần đọc trên tập đoàn trồng dồn BPH-6R và 102.73 triệu lần đọc trên tập đoàn trồng dồn BPH-6S. So sánh những reads này với genome tham chiếu Nipponbare, giá trị độ sâu trung bình (average resequencing depths) là 41.04-fold trong BPH-6R và 37.30-fold trong BPH-6S.
Đánh giá kiểu gen được thực hiện với 470063 chỉ thị SNP đa hình. Đa hình của bố mẹ dẫn đến giá trị SNP- index và vẽ được SNP-index graphs.
So sánh SNP-index graphs của tập đoàn BPH-6R và BPH-6S, người ta thấy có những biến thiên đối nghịch của SNP-index từ 1.20 đến 16.70 Mb trên nhiễm sắc thể 4. Cũng như vậy, biến thiên đối nghịch của SNP-index từ 10.20 đến 12.60 Mb trên nhiễm sắc thể 9.
Đoạn phân tử nằm trong quãng giữa 1.20-16.70 Mb trên nhiễm sắc thể 4, có giá trị trung bình SNP-index của tập đoàn BPH-6R bằng 1 hoặc gần bằng 1.0, trong khi giá trị này trong tập đoàn BPH-6S thấp hơn hoặc bằng 0.3.
Đoạn phân tử nằm trong quãng giữa 10.20-12.60 Mb trên nhiễm sắc thể 9, có giá trị trung bình SNP-index của tập đoàn BPH-6R lớn hơn 0.8. Trong khi giá trị này trong tập đoàn BPH-6S thấp hơn 0.4.
Kết quả khẳng định hai loci chủ lực liên quan đến tính kháng rầy nâu nằm trong vùng 1.20 - 16.70 Mb trên NST 4 và 10.20 - 12.60 Mb trên NST 9 của giống cho gen kháng RBPH660. Thực hiện narrow down vùng mục tiêu trên nhiễm sắc thể 4, phân tích QTL theo ICIM trong quần thể con lai F2:3. Có 309 dòng F2:3 được tìm thấy kiểu gen với 7 markers đa hình trên cơ sở điện di giữa RBPH660 và 9311, từ đó xây dựng bản đồ liên kết di truyền.
Đánh giá kiểu hình con lai F2:3 phản ứng với rầy nâu kết hợp với kết quả chạy QTL IciMapping 4.1, người ta xác định một locus điều khiển tính kháng BPH được đặt tên là Bph35, giải thích được 51.27% biến thiên kiểu hình, LOD score đạt 42.51, hai chỉ thị phân tử liền kề là InDel markers: PSM16 - R4M13.
Bản đồ di truyền phân giải cao gen Bph35, trên cơ sở dữ liệu F2, có bảy dòng recombinants đã được sàng lọc bởi chỉ thị PSM16 và R4M13.
Theo kết quả đánh giá kiểu gen và đánh giá kiểu hình của 7 dòng recombinants, gen Bph35 được phân lập có kích thước nằm trong vùng 650 kb giữa chỉ thị RM3471 và PSM20.
Phân tích gen ứng cử viên trong vùng chứa Bph35 người ta tập trung khu vực 6.28-6.93 Mb trên NST 4. Chạy trình tự bô và mẹ rồi so sánh ở đoạn phân tử ấy. Có tất cả 114 vị trí mang tính chất non-synonymous SNP được xác định trong vùng này. Giá trị SNP index của tất cả non-synonymous variant sites trong tập đoàn trồng dồn BPH-6R đạt 1.0 và trong tập đoàn BPH-6S biến thiên từ 0 đến 0.5.
Thực hiện fine mapping gen Bph35, một chỉ thị SSR và 3 chỉ thị InDel được sử dụng để sàng lọc di truyền các dòng recombinants. Kết quả là locus Bph35 được xác định nằm trong vùng từ 6.28 đến 6.93 Mb. Có tất cả 18 gen mã hóa protein tương ứng, với 114 vị trí biến thể của SNP mang tính chất không tương đồng giữa mẹ và bố. Ngoài những này, còn có gen Os04g0193950, mã hóa NB-ARC có tính giả định (nucleotide- binding adaptor shared by APAF-1, R proteins and CED-4) và mã hóa protein có domain LRR (leucine-rich repeat) với 9 vị trí biến thể của SNP mang tính chất không tương đồng giữa mẹ và bố.Như vậy đây chính là gen ứng cử viên của Bph35. Kết quả này sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho kỹ thuật dòng hóa trên cơ sở bản đồ di truyền gen mục tiêu (map-based cloning) đối với Bph35 và phát triển giống lúa cao sản kháng rầy nâu.
(Tài liệu trích dẫn màu đỏ có thể truy cập tư liệu nguồn được giới thiệu ở đầu bài)
(87).png)
Fig. 2. SNP-index graphs của tập đoàn trồng dồn BPH-6R bulk (A), BPH-6S bulk (B) và
Δ (SNP-index) (C) - theo kết quả phân tích BSA-seq analysis.
Trục X biểu thị vị trí của 12 nhiễm sắc thể 12
Trục Y-axis biểu thị giá trị SNP-index.
Đường biểu diễn màu đen là giá trị trung bình của SNP-index, đường xanh blue là ngưỡng kết hợp ở mức độ tin cậy 95%. Hai vùng trong genome (hộp màu cam) biểu thị tính kháng BPH trên NST 4 và 9.
GS. Bùi Chí Bửu - IAS, lược dịch.
Nguồn: Zhang và ctv. 2020. Identification of Major Locus Bph35 Resistance to Brown Planthopper in Rice. Rice Science 27(3): 237-245
Số lần xem: 644
