GS. Bùi Chí Bửu, IAS

Nguồn: xem danh mục tư liệu trích dẫn trong Ngân hàng Kiến Thức Trồng Hồ Tiêu, IAS

Giới thiệu chung

Cây hồ tiêu P. nigrum với 2n=52 thuộc dạng tứ bội (tetraploid), bản chất là cây tự thụ phấn (self-pollinated), nhưng thực tế thụ phấn chéo do kiến trúc hoa đực chín muộn hơn hoa cái. Trung tâm khởi nguyên của loài tiêu đen là Western Ghats thuộc miền Nam Ấn Độ, nơi mà mức độ đa dạng di truyền cây hồ tiêu rất lớn trong các giống tiêu trồng. Tính trạng liên quan đến phẩm chất gia vị, đặc biệt là ‘piperine’ (1-piperoylpiperidine, với những alkaloid chủ yếu) được đặc biệt nghiên cứu.

Hồ tiêu thuộc họ Piperaceae, lớp phụ Magnoliid, là loài thuộc “basal angiosperms” (ngành hiển hoa, hạt kín), nhưng có rất ít cơ sở dữ liệu về GENOMICS. Các cơ sở dữ liệu transcriptomic có nhiều phản hồi mang tính chất sinh thái và công nghệ sinh học, từ việc khai thác dữ liệu và định tính  sự tiến hóa trong họ thực vật cho đến việc xác định các chỉ thị phân tử microsatellites. Ngần ấy rất có giá trị phục vụ cho nội dung chọn tạo giống tiêu, xây dựng catalog của các gen biểu hiện có liên quan đến hệ thống tự vệ thực vật và cơ chế biến dưỡng.

Kích cỡ bộ genome hồ tiêu ước khoảng: 6,7 Gbp. Người ta đã công bố có 134 chuỗi trình tự trong cơ sở dữ liệu GeneBank  với “public domain” là 2011 trình tự.

Đa dạng di truyền

P. nigrum hiện nay thích nghi tương đối rộng, trồng được trên vùng đất có những cao trình khác nhau. Đặc điểm sinh thái canh tác hồ tiêu đa dạng đã dẫn đến tính đa dạng di truyền của nó (Howard, 1973). Hồ tiêu đã được sử dụng như thuốc thảo mộc, chống ô xi hóa (antioxidant), chống viêm nhiễm (anti-inflammatory), và chống ung bướu (anticancer) (Liu et al., 2010; Nishimura et al., 2011). Hàng năm, nông dân phải trồng dặm những cây đã mất do bệnh foot rot. Bệnh này rất quan trọng cho canh tác hồ tiêu tại nhiều quốc gia (Anandaraj, 2000). Một vài loài tiêu hoang dại như Piper colubrinum và Piper hainanense được xem như nguồn cho gen kháng sự xâm nhiễm của nấm Phytophthora capsici (Fan et al., 2015). Người ta thực hiện phân tích đa dạng di truyền hồ tiêu với 148 mẫu giống, bao gồm loài hoang dại và giống trồng trọt tại châu Á và châu Mỹ, thông qua chỉ thị phân tử transcriptome EST-SSR. Hiểu biết về quỹ gen cây hồ tiêu là điều rất quan trọng trong chương trình cải tiến giống tiêu và ghép cành giống, cũng như hoạt động bảo tồn quỹ gen cây tiêu. người ta khai thác 13 chỉ thị phân tử được chọn, có khả năng khuếch đại thành công những loci đích trong tập đoàn quỹ gen cây trồng hồ tiêu. Tất cả chỉ thị phân tử EST-SSR biểu thị tính đa hình cao với giá trị trung bình PIC (polymorphism information content) là 0,93. Chỉ số tương đồng di truyền biến thiên 0,724 đến 1,000, trung bình là 0,867. Kết quả chỉ ra rằng quỹ gen cây hồ tiêu biểu hiện nần tảng di truyền rất phức tạp và rất đa dạng. Theo kết quả phân tích nhóm di truyền, 148 mẫu giống này được chia thành hai clades chủ yếu: đó là Neotropics và Asian tropics. Peperomia pellucida được xếp vào nhóm riêng biệt, có khoảng cách di truyền xa với những mẫu giống khác. Kết quả cho thấy có sự thống nhất khoảng cách di truyền và khoảng cách địa lý. Tuy nhiên, nhóm di truyền Asian tropics không tạo nên cluster theo nguồn gốc địa lý của chúng. Hơn nữa, so với mẫu giống hồ tiêu châu Mỹ, mẫu loài hoang dại Á châu và mẫu giống trồng trọt Á châu tập họp trong cùng một nhóm di truyền, cho thấy tương quan rất gần về huyết thống (Wu et al. 2016).

Giải trình tự hệ gen cây hồ tiêu

Áp dụng kỹ thuật NGS (next generation sequencing) để giải mã trình tự của bộ genome và bộ transcriptome cây hồ tiêu. Kết quả giải trình tự de novo thông qua phần mềm IlluminaHiSeq™ 2000 để tạo ra bộ transcriptome đầu tiên trên lá tiêu (Piper nigrum L.), từ một giống tiêu bản địa ở miền Nam Ấn Độ (Joy et al. 2013). Kết quả của 55 triệu “reads” đầu tiên đã được lưu trữ. Từ đó, người ta đã tổng hợp lại kết quả đọc nói trên nhờ chương trình Trinity để sáng tạo ra 2.230.386 phân tử chồng lấp (contigs) và có tất cả 1.280.157 đoạn mang unigenes.

Kết quả được ghi nhận là hệ transcriptome rễ cây hồ tiêu được giải trình tự theo nền tảng NGS SOLiD (phương pháp giải trình tự thế hệ mới) rồi được tổng hợp theo phương pháp Multiple-k. Người ta giải thích chi tiết chuỗi trình tự này bằng bằng phương pháp Blast2Go và orthoMCL với tất cả 10.338 unigenes. Có tất cả 4472 proteins được dự đoán, biểu thị khoảng 52% bản chất đồng dạng (homology) so với hệ proteome của cây Arabidopsis thaliana. Hai proteomes của rễ được xác định với 615 proteins, chúng dường như phản ánh được bản chất của rễ cây hồ tiêu. Chỉ thị phân tử SSRs tỏ ra vô cùng hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền cây hồ tiêu, được áp dụng trong công nghệ sinh học và sinh môi học. Cơ sở dữ liệu của 10338 unigenes này vô cùng quan trọng cho chương trình cải tiến giống tiêu bằng công nghệ sinh học cũng như cho nghiên cứu ecogenomics (Gordo et al. 2012).

Di truyền tính kháng với bệnh do nấm Phytophtora capsici và Fusarium solani f. sp. piperis, chưa thành công trong chương trình cải tiến giống tiêu, đây là thách thức rất lớn cần được sự hỗ trợ của công nghệ sinh học (Nair 2011). Despite the agricultural and economic importance of black pepper, knowledge of its genetics is presently very limited (Dias và Ortiz 2011). Hồ tiêu không phải là cây mô hình, do vậy cơ sở dữ liệu về chỉ thị phân tử, giải trình tự thế hệ mới (NGS) là cơ hội rất lớn để các nhà khoa học tiê1p cận nhanh hơn các thông tin di truyền hiện đại (Hawkin et al. 2010; Lister et al. 2009, Morozova et al. 2009; Wang et al. 2009). Trong sinh học thực vật, do kích cỡ của genomes lớn và mức độ đa bội thể cao, việc định tính hệ transcriptomes cần phải được xem là một công cụ rất quyền lực để phân lập những proteins mong muốn. RNA-seq có thể chạy trình tự, có tính chất hiệu quả kỹ thuật rất tốt (extremely high-throughput) và phản ánh được số lượng của hệ transcriptome một sinh vật nào đó hay một mô nào đó (Wang et al. 2009). Công nghệ NGS phát sinh ra số lượng vô cùng lớn số lần đọc trình tự (reads) với mức độ lấy mẫu rất cao của thư viện cDNA, do đó, kết quả làm cho chúng ta có cách nhìn sâu hơn và toàn diện hơn hệ transcriptomes (Morozova et al. 2009). Chạy trình tự theo phương pháp transcriptome-wide description xác định được trình tự mang mật mã di truyền, chỉ thị SNPs, những đa hình khác, biến thể của nội dung splicing (nối exon và cắt rời intron), mức độ biểu hiện tương đối do kỹ thuật đếm số lần đọc (counting reads) - phương pháp mang tính chất biểu hiện gen được số hóa (digital gene expression: DGE) (Wang et al. 2009; Nagalakhsmi et al. 2010). Phân tích RNA-seq hệ transcriptome của hồ tiêu có thể tác động lớn trong hiểu biết của chúng ta về loài cây trồng này. Hồ tiêu thuộc họ Piperaceae, lớp phụ Magnoliid, là thực vật basal angiosperms (hạt kín điển hinh), nhưng cơ sở dữ liệu genomic ít được công bố. Cơ sở dữ liệu transcriptomic từ khai thác sự tiến hóa của họ Piperaceae, người ta có thể phát triển chỉ thị phân tử microsatellites vô cùng hữu ích cho các chương trình cải tiến giống hồ tiêu.

Thiết kế chỉ thị SSR cho hồ tiêu

Joy và ctv. (2013) đã sử dụng một bộ chip có tên là “array of transcripts” để dự đoán và phát hiện in silico của 43 phân tử ứng cử viên mang tên “pre-miRNA” mang các motif khác nhau của chỉ thị SSR. Họ phân tích và xác định được 3913 các loại hình khác nhau của những motif chỉ thị SSR với trung bình một chỉ thị SSR trên đoạn phân tử 3,04 MB trong bộ transcriptome này. Khoảng 0,033% transcriptome là những ứng cử viên “pre-miRNA” mang chỉ thị SSRs. Mức độ phong phú, kiểu hình và cách phân bố của những motif chỉ thị SSR đều được nghiên cứu thông qua các tiền thân của phân tử miRNA dạng kẹp tóc.

Kumari et al. (2019) liệt kê tất cả 69.126 chỉ thị SSRs đã được phân lập từ kết quả assembling hệ gen cây tiêu P. nigrum. Tần suất SSR đạt 158 trên mỗi Mb có nghĩa là một SSR trên 6,3 kb trong genome cây tiêu. Trong số các loại hình khác nhau của motif SSR tại những vi vệ tinh, motif có hai chữ lập lại (dinucleotides) chiếm nhiều nhất 48,6%, theo sau là motif ba chữ (trinucleotide) chiếm 23,7% và motif còn lại (compound repeats) chiếm 20,62%. Sử dụng một bô chỉ thị bao gồm 85 SSRs để minh chứng, người ta thấy có 74 cho ra sản phẩm PCR khuếch đại với kích thước mong muốn. Đa dạng di truyền của 30 mẫu giống hồ tiêu thông qua chạy điện di 50 chỉ thị SSRs cho kết quả có 4 nhóm di truyền khác biệt nhau. Bên cạnh đó, các loài giao thoa nhau trong tự nhiên có thể chuyển đổi chỉ thị SSRs, điều này được kiểm tra lại trong 9 loài hồ tiêu hoang dại. Trong số 50 chỉ thị SSRs này, có 19 chỉ thị được khuếch đại trong 9 loài Piper và 31 chỉ thị SSRs được khuếch đại trong 7 loài Piper. Như vậy, chỉ thị SSRs có thể được áp dụng cho loài khác thuộc chi  Piper, mà nơi ấy  trình tự của hệ gen chưa sẵn sàng. Đây là nghiên cứu đầu tiên ứng dụng chỉ thị SSR trên cơ sở NGS trong genome cây tiêu (Kumari et al. 2019).

Transcriptome của rễ tiêu

Nghiên cứu hệ transcriptome của rễ tiêu (Gordo et al. 2012) cho thấy: Piper nigrum L. có sự tương tác giữa pathogens và rễ cây chủ vô cùng quan trọng để chúng ta xác định giống hồ tiêu kháng bệnh thông qua kỹ thuật chọn giống nhờ biện pháp di truyền phân tử. Bộ dữ liệu đồ sộ của 10.338 unigenes trở nên vô cùng quan trọng cho việc chọn giống tiêu nhờ chỉ thị phân tử và nghiên cứu “ecogenomics” của ngành thực vật hiển hoa, hạt kín.

Theo hệ transcriptome của hồ tiêu (NCBI accession No. SRX119532), chỉ thị EST-SSR đã được phát triển thành công và được áp dụng cho hệ gen hồ tiêu (Wu et al. 2015).

Gordo et al. (2012) đã sử dụng kỹ thuật RNA-seq để phân tích hệ transcriptome của cây hồ tiêu. Có khoảng 71 triệu reads phát sinh và 22363 phân tử transcript de novo được tổng hợp từ mô của rễ tiêu và thân tiêu. Những phân tử transcripts này có chức đăng được xác định bằng phần mềm annotation; đây là lần chạy trình tự đầu tiên từ hệ transcriptome của P. nigrum. Người ta mô tả được khoảng 257 chỉ thị SSRs mới. Đây là cơ sở dữ liệu đầu tiên về trình tự của lớp phụ Magnoliid. Kết quả mở ra những triển vọng mới để nghiên cứu đa dạng di truyền và sinh môi học. Nó sẽ rất có ích cho chương trình cải tiến giống và nghiên cứu hệ gen cây hồ tiêu để hiểu rõ hơn tương tác giữa ký sinh và ký chủ tại rễ hồ tiêu, nơi bị tấn công bởi nấm  F. solani và P. capsici (Gordo et al. 2012).

Transcriptome của hạt tiêu

Nghiên cứu đầu tiên về hệ transcriptome của hạt tiêu (fruit transcriptome) thông qua chạy trình tự Illumina HiSeq 2000 (Hu et al. 2015). Kết quả tổng cộng 56.281.710 reads chưa sàng lọc (raw reads) được thu thập và thao tác tổng hợp (assembled). Từ những kết quả raw reads như vậy, người ta ghi nhận 44.061 unigenes, trung bình mỗi gen có độ lớn phân tử là 1.345 nt. Thực hiện kỹ thuật chú thích chi tiết di truyền (functional annotation), có 40.537 unigenes được chú thích  theo Gene Ontology categories, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathways, Swiss-Prot database, và cơ sở dữ liệu Nucleotide Collection (NR/NT). Bên cạnh đó, số chỉ thị phân tử SSRs được tìm thấy là 8.196 markers. Phân tích chi tiết hệ transcriptome ngày, người ta xác nhận được những gen mang tính chất housekeeping (gen không có chức năng) phục vụ chạy PCR để kiểm tra, những chỉ thị SSRs đa hình cao, và những gen liên quan đến biến dưỡng lysine/ornithine. Kết quả này minh chứng khả năng khai thác cơ sở dữ liệu của Hu và ctv. (2015) rất tốt. Đặc biệt là nghiên cứu quá trình tổng hợp nên chất piperine của hồ tiêu (Hu et al. 2015). Ước khoảng 56 triệu clean reads được thu thập và số unigenes là 44.061 gen được tổng hợp lại de novo. Gen mang tính chất housekeeping, gen có liên quan đến lysine/ornithine, cặp mồi của chỉ thị phân tử SSRs đa hình đã được xác định. Công trình nghiên cứu ấy là cơ sở dữ liệu đầu tiên được thực hiện trên hạt tiêu. Công trình này cung cấp một thư viện gen (gene library) vô cùng hữu ích phục vụ nghiên cứu di truyền phân tử cây hồ tiêu (Hu et al. 2015).

Di truyền tính kháng bệnh chết nhanh

Piper nigrum L. bị đe dọa nghiêm trọng bởi nấm Phytophthora capsici. Cải tiến di truyền tính kháng bệnh foot rot này là mục tiêu quan trọng cho chương trình chọn giống hồ tiêu. Tuy nhiên, người ta biết quá ít về cơ chế kháng của nấm P. capsici đối với cây chủ Piper nigrum. Cơ chế phân tử phản ứng nhiễm bệnh foot rot đã được nghiên cứu thông qua phân tích hệ transcriptome giữa loài tiêu kháng (Piper flaviflorum) và giống tiêu nhiễm (Piper nigrum cv. Reyin-1) (Hao et al. 2016). Có tất cả 116.432 unigenes được tìm thấy từ sáu thư viện cDNA (ba replicates mang tính kháng và tính nhiễm), chúng được hợp nhất vào với nhau nhờ áp dụng BLAST similarity và tra cứu bộ dữ liệu Kyoto Encyclopaedia of Genes and Gene Ontology (GO) genome orthology. Hệ transcriptome tham chiếu được lập thành bản đồ với hai cơ sở dữ liệu về biểu hiện gen được số hóa (digital gene expression data). Thông qua phân tích mức độ phong phú GO đối với những gen biểu hiện ra bên ngoài rất khác nhau, đa phần gen này kết hợp với chu trình sinh tổng hợp phenyl propanoid được tìm thấy trong loài tiêu hoang dại P. flaviflorum. Hơn nữa, sự biểu hiện của những gen ấy được quan sát sau khi chủng nấm P. capsici trên cây nhiễm và cây kháng. Đa số gen tham dự vào chu trình biến dưỡng phenyl propanoid. Chúng điều tiết theo kiểu up trong cả hai loài tiêu đang nghiên cứu. So sánh những nghiệm thức xử lý và cơ quan được xử lý, tất cả gen điều tiết theo kiểu up với tỷ lệ biểu hiện cao ở loài tiêu kháng. Hoạt tính men phenylalanine ammonia lyase và peroxidase tăng trong loài kháng và nhiễm bệnh sau khi chủng nấm P. capsici, nhưng loài tiêu kháng tăng nhanh hơn rất nhiều. Cây tiêu kháng duy trì được cấu trúc mạch dẫn truyền trong bó lignin, theo kết quả phân tích mô học. Đây là thông tin quan trọng liên quan đến những gen đích và cơ sở kỹ thuật cho nghiên cứu của tương lai về cải tiến di truyền tính kháng bệnh chết nhanh của hồ tiêu, kể cả chọn giống bằng con đường chuyển nạp gen (Hao et al. 2016).

Di truyền tính trạng peperine

Hồ tiêu (Piper nigrum) được nghiên cứu với hệ gen tham chiếu trong trường hợp mã hóa piperine, bởi tích hợp được công nghệ PacBio, 10x Chromium, BioNano DLS optical mapping, và Hi-C mapping (Hu et al. 2019). Trình tự hệ gen chạy được 761,2 Mb (bao gồm 45 scaffolds với độ lớn N50 là 29,8 Mb); người ta tổng hợp các trình tự đọc được thành 26 pseudochromosomes (nhiễm sắc thể tạm thời). Phân tích di truyền huyết thống của những genomes đặc trưng thuộc lớp phụ Magnoliids như dòng sister đối với clade có tính chất monocots-eudicots cho thấy rằng: hồ tiêu có nguồn gốc tiến hóa từ Laurales-Magnoliales lineage khoảng 180 triệu năm trước đây. Phân tích genome có tính chất so sánh cho thấy sự lan rộng ảnh hưởng của những họ gen đặc biệt mã hóa các men glycosyltransferase, cytochrome P450, shikimate hydroxycinnamoyl transferase, lysine decarboxylase, và acyltransferase. Phân tích transcriptome có tính chất so sánh chỉ ra rõ ràng hơn cách biểu hiện đặc sắc của điều tiết kiểu up trong những gen như vậy thuộc các họ gen có liên quan. Cơ sở dữ liệu này cung cấp một nội dung có tính chất tiến hóa và làm sáng tỏ các tiến trình biến dưỡng ở mức độ phân tử về sinh tổng hợp chất piperine rất chuyên biệt theo loài (species-specific) (Hu et al. 2019).