Capsicum annuum là một loài ớt đã thuần hóa thuộc chi Capsicum, họ Cà (Solanaceae) có nguồn gốc từ miền Nam Bắc Mỹ và miền bắc Nam Mỹ. Ba loài C. annuum, C. frutescens và C. chinense đều tiến hóa từ một tổ tiên chung duy nhất ở một nơi nào đó trong khu vực phía tây bắc Brazil – Colombia. Số nhiễm sắc thể của bộ genome cây ớt là: 12 cặp.

Trong chi Capsicum, có ít nhất 31 species được biết, năm trong số loài này được thuần hóa thông qua những sự kiện rất khác biệt nhau tại những trung tâm khởi thủy về đa dạng sinh học khác nhau: C. annuum, C. baccatum, C. chinense, C. frutescens và C. pubescens. Loài ớt được thuần hóa Capsicum spp., trong đó loài C. annuum được trồng với diện tích lớn nhất trên tế giới với hai kiểu hình ớt ngọt và ớt cay, được người ta thực hiện nhiều chương trình lai chọn tạo giống mạnh nhất. Capsicum annuum đã được thuần hóa trên cao nguyên Mexico và là tổ tiên của các giống ớt cay Mexico, hầu hết giống ớt cay châu Phi và châu Á, cùng với nhiều giống ớt ngọt trồng ở châu Âu, vùng ôn đới (Livingstone và ctv. 1999).

Người ta sử dụng GBS (genotyping by sequencing) với bộ chỉ thị “genome-wide SNPs”, thực hiện trên tập đoàn giống ớt với 370 mẫu giống (accessions), để đánh giá đa dạng di truyền của một “subset” với 222 giống ớt đang canh tác (C. annum) bao gồm giống bản địa, giống canh tác chủ lực, giống lai, dòng cải tiến, dòng hoang dại và dòng ớt kiểng (ornamental) được sưu tập từ nhiều vùng của thế giới (Taranto và ctv. 2016). Kỹ thuật “SNP discovery by GBS” được áp dụng trong nghiên cứu này. Ly trích mẫu DNA theo phương pháp DNeasy® Plant Mini Kit (QIAGEN, Germany). Phân cắt hạn chế mẫu DNA bằng “6-base-cutter HindIII”. GBS được thực hiện tại “Institute of Genomic Diversity” (Cornell University, Ithaca, NY, USA) theo phương pháp Elshire. Khuếch đại PCR được tiến hành để tạo nên một thư viện GBS, mà kết quả này được minh họa bởi kỹ thuật “Illumina HiSeq 2500 run” (Illumina Inc., USA). Trình tự DNA với hàng triệu “reads” được xử lý theo “multiple FASTQ files”. Tất cả chỉ thị (tag) của trình tự duy nhất của mỗi một “sequence file” được thu thập và xử lý để tạo ra “master tag file”. Những “master tags” này được sắp xếp và so sánh chuỗi trình tự theo cách thức tham chiếu cơ sở dữ liệu của bộ genome CM334 trên mạng http://peppergenome.snu.ac.kr với công cụ Burrows-Wheeler Aligner (BWA) (version 0.7.8-r455).

Phân tích GBS theo phần mềm TASSEL (version 3.0.166) để xử lý số liệu SNPs. Cở sở dữ liệu SNP được xử lý theo TASSEL-GBS sẽ cho ra dữ liệu mới trong đánh giá kiểu gen “HapMap” có tính chất còn nguyên sơ. Sau đó, người ta tiến hành tiếp sau đó hai bước có tính chất thanh lọc (filtering)  những chỉ thị SNPs. Lần “filtering” đầu tiên nhằm tìm ra tần suất alen tối thiểu (mnMAF = 0.01), mức che phủ tối thiểu để phân loại [minimum taxa coverage] (mnTCov = 0.1) và vị trí được che phủ tối thiểu [minimum site coverage] (mnSCov = 0.8). Các mẫu giống ớt có số dữ liệu bị mất với mức độ khá lớn sẽ được thanh lọc trên cơ sở tham chiếu “minimum minor allele count” (mnMAC = 10). Các chỉ thị SNPs vượt cao hơn giá trị  “minimum minor allele count” (mnMAC) hoặc có tần suất lớn (mnMAF), được giữa lại để phân tích tiếp.

Lần “filtering” thứ hai nhằm chọn ra các chỉ thị SNP có chất lượng cao thông qua phần mềm TASSEL-GBS cho ra những thông số sau đây: “minimum count 150”, “minimum frequency 0.01” và “Maximum Frequency 1.0”.

Người ta thu thập số liệu “read depth” và “coverage” thông qua việc sử dụng “custom R scripts” và “BEDTools”. Muốn xác định vùng trung tâm trên 12 nhiễm sắc thể của Capsicum, người ta sử dụng bản đồ di truyền của giống ớt COSII. Mỗi một nhiễm sắc thể, người ta chọn những chỉ thị phân tử kế cận với “peri-centromeric region” và xác định vị trí chính xác của chúng từ cơ sở thông tin của phần mềm “Sol Genomics Network”.

Tất cả chuỗi trình tự DNA có trong “NCBI Short Read Archive” (SRA; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/) với mã số mẫu giống ớt là SRP070992.

Kết quả cho thấy: phân tích GBS ghi nhận có 7.568.894 “master tags” (chỉ thị phân tử chính), trong đó, có 43.4% trình tự mang tính chất “unique” (độc nhất hiện hữu) được so sánh với bộ genome tham chiếu CM334. Người ta thấy có tất cả 108.591 chỉ thị SNP được xác định, trong đó, 105.184 chỉ thị SNP được tìm thấy trong các mẫu giống của C. annuum. Muốn khai thác có hiệu quả kết quả đa dạng di truyền này trong cây C. annuum và muốn chọn lọc một bộ “minimal core” đặc trưng cho tất cả biến dị di truyền đạt giá trị “minimum redundancy”, người ta phải tạo ra một “subset” của 222 mẫu giống ớt C. annuum, chúng được phân tích thông qua 32.950 chỉ thị SNP chất lượng cao. Theo kết quả xếp nhóm di truyền, người ta có thể chia tập đoàn giống ớt ra thành ba clusters di truyền. Cluster I tập hợp các giống đang canh tác chủ lực và giống ớt bản địa của vùng Nam và Bắc Italy, và vùng Đông Âu. Clusters II và III thể hiện các mẫu giống ớt có nguồn gốc địa lý khác. Xem xét kết quả phân tích biến thiên di truyền có tính chất “genome-wide” trong những mẫu giống ớt thử nghiệm này, bao gồm cluster I, với một chu kỳ thứ cấp theo phân nhóm của Bayesian (K = 3) và Hierarchical (K = 2); chúng đã được thực hiện để hoàn tất sự phân nhóm di truyền. Kết quả cho thấy rằng: các mẫu giống ớt đã được xếp nhóm di truyền không chỉ dựa theo xuất xứ địa lý mà con dựa trên đặc điểm có liên quan đến quả ớt.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Livingstone Kevin D., Vincent K. Lackney, James R. Blauth, Rik van Wijk and Molly Kyle Jahn. 1999. Genome Mapping in Capsicum and the Evolution of Genome Structure in the Solanaceae. Genetics 152: 1183–1202 ( July 1999)

Taranto F., N. D ’Agostino, B. Greco, T. Cardi and P. Tripod. 2016.  Genome-wide SNP discovery and population structure analysis in pepper (Capsicum annuum ) using genotyping by sequencing. BMC Genomics  (2016) 17:943

Hình: Ước lượng mức độ đa dạng di truyền của 222 mẫu giống ớt  C. annuum th6ong qua sử dụng 32.950 SNP markers. [a] Bar-plot biểu hiện cấu trúc quần thể theo “Bayesian clustering”. Mỗi cá thể được biểu trưng bằng một vạch ngang cự nhỏ, mà nó tương ứng với các đoạn K có màu sắc, chiều dài của đoạn này tương ứng với giá trị thành viên nhóm (membership coefficient: q). Quần thể được phân ra thành ba nhóm di truyền (K = 3) theo giá trị K có mức độ thông tin cao nhất. Các đường ngang màu đen  phân tách các cá thể ra thành những clusters khác nhau. [b] “Dendrogram plot” là kết quả của phân nhóm theo kiểu “non-parametric hierarchical”. D2 cho thấy sự chia sẻ các alen với khoảng cách khác nhau. Đường thẳng màu đan, liên tục tách các cá thể ra  thành những “sub-populations” khác nhau. Quần thể có ba nhóm di truyền (K = 3) tùy theo giá trị K có hàm lượng thông tin cao nhất.

GS. Bùi Chí Bửu lược dịch.