|
Trang chủ >> Thông tin khoa học >> Công cụ phẫu thuật bộ gene
Thư viện ảnh
Thống kê truy cập
 Đang trực tuyến :
23 |
|
 Số lượt truy cập :
33274427 |
|
|
|
|
|
Công cụ phẫu thuật bộ gene
Thứ sáu, 15-03-2013 | 07:58:56
|
|
Y học hiện đại đang nhắm tới liệu pháp gene. Rất nhiều bệnh tật ở người là do gene quy định, đôi khi đột biến xảy ra ở chỉ một nucleotide cũng đã đủ gây bệnh. Nếu muốn khôi phục chức năng của gene bị đột biến, y học phải có được khả năng “phẫu thuật”, cắt gene chính xác tại nucleotide bị đột biến trong số hơn 3 tỷ nucleotide của bộ gene người. Để đạt được độ chính xác cao như vậy, người ta phải dùng tới các enzyme có khả năng nhận biết đặc biệt. Khoa học đã sử dụng các enzyme cắt DNA (DNA nuclease) được thiết kế có chức năng bám đặc hiệu vào những đoạn DNA nhất định nhằm chỉnh sửa bộ gene eukaryotae. Tuy nhiên, các kỹ thuật dựa trên thiết kế protein này lại có khuyết điểm là phải mất nhiều công sức điều chỉnh chức năng bám đặc hiệu của enzyme mỗi khi ta muốn thay đổi vị trí mục tiêu trên bộ gene. Tạp chí Science trong tháng 02/2013 đã công bố hai công trình nghiên cứu sử dụng RNA (thay vì enzyme protein như lâu nay) cho mục đích chỉnh sửa bộ gene người. Công trình thứ nhất là kết quả hợp tác giữa nhóm nghiên cứu của Tiến sĩ Trương Phượng (Feng Zhang) tại Viện Broad (cơ quan hợp tác giữa Đại học Harvard và Học viện công nghệ Massachussetts, Mỹ) cùng nhóm nghiên cứu của Tiến sĩ Luciano Marraffini ở Đại học Rockerfeller (Mỹ). Công trình thứ hai do nhóm nghiên cứu của Giáo sư George M. Church ở Đại học Harvard (Mỹ) thực hiện.
Enzyme cắt DNA (endonuclease) có khả năng cắt tại các vị trí chuyên biệt một cách chính xác trên bộ gene. Tuỳ theo dạng cắt (cắt một mạch hay cả hai mạch DNA), và tuỳ theo cơ chế sửa chữa DNA được kích hoạt (sửa chữa đồng dạng hoặc phi đồng dạng) mà đoạn DNA sẽ giữ nguyên hay thay đổi trình tự tại vị trí cắt sau khi được nối lại. Nếu cơ chế sửa chữa phi đồng dạng (nonhomologous) được kích hoạt, thì sự thay đổi trình tự có thể là trao đổi đoạn với một đoạn DNA được thiết kế (dẫn đến thay đổi trình tự gene hoặc chèn gene mới) hoặc là thêm đoạn hay mất đoạn tại vị trí nối DNA bị cắt.
Các enzyme cắt giới hạn truyền thống không phù hợp trong kỹ thuật biến đổi bộ gene vì trình tự nhận biết của chúng rất ngắn (từ 4 đến 8 nucleotide) và có rất nhiều trình tự giống nhau như vậy trong một bộ gene. Do vậy, người ta phải sử dụng các enzyme cắt DNA đặc biệt gọi là enzyme “tìm nhà” (homing endonuclease) với đặc tính nhận biết trình tự dài hơn (20 đến 30 nucleotide). Tuy vậy, việc thiết kế các enzyme này tốn rất nhiều công sức. Gần đây hơn, các nhà khoa học đã thiết kế một dạng enzyme khảm (chimeric) với một phần cấu trúc từ nuclease có chức năng cắt DNA và một phần cấu trúc có chức năng nhận dạng DNA. Một loại enzyme thể khảm như vậy là nuclease ngón tay kẽm (zinc finger nuclease), bao gồm một nuclease hợp nhất với một bộ các cấu trúc ngón tay kẽm, mỗi cấu trúc như vậy tương tác với 3 nucleotide, và một nuclease ngón tay kẽm nhận biết một đoạn DNA lên tới 36 nucleotide. Người ta thay đổi khả năng nhận biết các trình tự khác nhau của nuclease ngón tay kẽm bằng cách thay đổi các cấu trúc ngón tay kẽm với độ chuyên biệt đã biết trước. Một dạng enzyme thể khảm khác là nuclease giống nhân tố kích hoạt phiên mã (TALEN – transcription activator-like effector nuclease), bao gồm một nuclease hợp nhất với một protein có từ 12 đến 26 vùng cấu trúc, mỗi vùng tương tác với một nucleotide. Do vậy, mỗi TALEN có khả năng nhận biết một trình tự chuyên biệt có ít nhất là 24 nucleotide. Dùng các enzyme thể khảm này, người ta có thể thay đổi khả năng nhận biết đoạn DNA mục tiêu một cách dễ dàng.
Các nhà khoa học cũng sử dụng một chiến lược rất tốt khác là sử dụng các đoạn nucleotide ngắn (oligonucleotide) để nhận biết trình tự DNA mục tiêu. Thành quả đầu tiên của chiến lược này là một enzyme cắt giới hạn hợp nhất với một oligonucleotide có cấu trúc ba xoắn (triple helix) ngắn. Phương pháp này lại có hạn chế là sự hình thành cấu trúc ba xoắn với các đoạn DNA chỉ có purine hoặc pyrimidine.
Người ta đặc biệt chú ý đến một Cas type-II là Cas9, có khả năng cắt cả hai mạch DNA ở một vị trí chuyên biệt. Khả năng hướng dẫn nuclease của crRNA cần đến một đoạn RNA thứ hai là crRNA hoạt tính trans (tracrRNA) và một ribonuclease (RNAse III). Khi mang cả crRNA và tracrRNA (hay một thể khảm nhân tạo của hai loại RNA này), Cas9 sẽ cắt đoạn DNA có trình tự bổ sung với phần trình tự đưa ra bên ngoài của crRNA. Thí nghiệm cắt plasmid in vitro cho thấy hệ thống CRISPR–Cas là một công cụ hứa hẹn trong kỹ thuật sinh học phân tử.
Cả hai công trình vừa công bố trên Science tháng 02/2013 đều ứng dụng Cas9 để chỉnh sửa bộ gene động vật hữu nhũ. Cả hai đều biểu hiện Cas9 trong nhân tế bào người nuôi cấy. Cas9 được trang bị crRNA hướng dẫn và tracrRNA hỗ trợ được thiết kế để nhận diện mục tiêu DNA cần cắt. Đoạn DNA bị cắt được sửa chữa một phần bằng cơ chế nối phi đồng dạng, vốn thường dẫn đến hiện tượng mất hoặc chèn đoạn DNA nhỏ. Dạng Cas9 trong tự nhiên sẽ cắt cả hai mạch DNA, nhưng hai nhóm nghiên cứu đã sử dụng một dạng đột biến của Cas9 trong đó một trong số các trung tâm hoạt tính của nuclease bị mất chức năng, do vậy chỉ cắt được một trong hai mạch DNA mục tiêu. Thông thường thì cơ chế chỉnh sửa phi đồng dạng sẽ bị kém đi do chỉ một mạch DNA bị cắt, tuy nhiên, cả hai nhóm đã cho thấy các đột biến ngoài mục tiêu giảm đi do có sự chèn và mất đoạn. Thí nghiệm của họ đã chèn thành công DNA ngoại lai vào vị trí bị cắt. Hơn nữa, nếu cắt DNA mục tiêu ở hai vị trí liên tiếp trên cả hai mạch thì đoạn DNA chèn sẽ bị cắt ra. Các nhà khoa học này cũng chứng minh được khả năng chỉnh sửa DNA trên quy mô lớn vì họ có thể đồng thời cắt được nhiều DNA mục tiêu ở các vị trí khác nhau. Một nhóm nghiên cứu khác do Giáo sư Jennifer A. Doudna ở Đại học California–Berkeley (Mỹ) cũng vừa công bố việc sử dụng Cas9 cắt cả hai mạch DNA để chỉnh sửa bộ gene trong tế bào người. Hiệu quả cắt của Cas9 tuỳ thuộc chủ yếu vào cách thiết kế RNA thể khảm, điều này cho thấy khả năng tối ưu hoá chức năng chỉnh sửa bộ gene của Cas9.
Các chiến lược chỉnh sửa bộ gene trực tiếp như trên mạng lại nhiều lợi ích rất lớn về cơ bản cũng như ứng dụng trong kỹ thuật di truyền. Đặc biệt là trong y học, độ chính xác trong nhận biết mục tiêu là rất quan trọng vì những chỉnh sửa chệch mục tiêu sẽ gây ảnh hưởng đến sự an toàn của toàn bộ quá trình chữa trị, do đó các cơ chế chỉnh sửa DNA phải nhận biết được một cách chuyên biệt các đoạn DNA mục tiêu dài. Ngoài ra, việc thay đổi tính chuyên biệt của các công cụ chỉnh sửa DNA cũng phải thuận tiện với chi phí vừa phải. Đây là ưu điểm của hệ thống Cas9 vì chỉ cần thay đổi trình tự RNA hướng dẫn thì người ta đã thay đổi được tính chuyên biệt của nó. Ngoài ra cũng phải xem xét đến khả năng tái tổ hợp nhanh, hiệu quả, và có thể thực hiện trên quy mô lớn được. So với các hệ thống chỉnh sửa DNA tốt nhất hiện nay (nuclease ngón tay kẽm và TALEN) thì Cas9 đều đạt các yêu cầu này tốt hơn. Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu vẫn nên cải thiện thêm độ chuyên biệt và tính hiệu quả của Cas9, chẳng hạn như bằng phương pháp tiến hoá trong phòng thí nghiệm. Tuy cần phải có thêm thời gian mới ứng dụng được các kỹ thuật chỉnh sửa DNA này vào liệu pháp gene để chữa trị các bệnh di truyền ở người một cách hiệu quả, nhưng những thành tựu nghiên cứu trên đây cho thấy giới khoa học đã tiến rất gần đến đích.
N.T. Đôn - Hcmbiotech.
|
Trở lại
In
Số lần xem: 3084
|
|
[ Tin tức liên quan ]___________________________________________________
|
