|
Trang chủ >> Thông tin khoa học >> Sáng chế mới từ một phát hiện loài tuyến trùng mới cho khoa học
Thư viện ảnh
Thống kê truy cập
 Đang trực tuyến :
25 |
|
 Số lượt truy cập :
33270222 |
|
|
|
|
|
Sáng chế mới từ một phát hiện loài tuyến trùng mới cho khoa học
Thứ hai, 07-06-2021 | 08:25:02
|
|
Nguyễn Ngọc Châu - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật
Một sáng chế mới thuộc lĩnh vực bảo vệ thực vật - sáng chế có tên là: "Phương pháp phòng trừ ve sầu hại cà phê bằng chế phẩm sinh học chứa tuyến trùng Steinernema phuquocense n. sp. S-Q16". Chủ bằng độc quyền: Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Tác giả: Nguyễn Ngọc Châu, Đỗ Tuấn Anh, Nguyễn Hữu Tiền. Sáng chế đề cập đến phương pháp phòng trừ ve sầu hại cà phê bằng chế phẩm sinh học chứa tuyến trùng Steinernema phuquocense n. sp. S-PQ16. Trong đó, tuyến trùng S-PQ16 này là chủng tuyến trùng mới do Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật phân lập và lưu giữ. Chế phẩm sinh học tuyến trùng S-PQ16 là chế phẩm sinh học đầu tiên diệt được ấu trùng ve sầu hại cà phê. Chế phẩm rất có ý nghĩa về kinh tế - xã hội và giúp bảo vệ sức khỏe cộng đồng do không dùng thuốc hóa học độc hại.
Từ một phát hiện bất ngờ
Trong chuyến khảo sát thu mẫu năm 2014 tại đảo Phú Quốc, từ các mẫu đất cát sinh cảnh ven biển bằng phương pháp sử dụng côn trùng bẫy là ấu trùng bướm sáp lớn (Galleria mellonella) nhóm nghiên cứu tuyến trùng của Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã phân lập được 2 chủng tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng giống Steinernema, trong đó có một khá đặc biệt về độc lực, chỉ qua một ngày cả 5 côn trùng bẫy đều chết trong trạng thái tan vữa (chứng tỏ độc lực của chủng tuyến trùng cực kỳ cao). Ngay lập tức chủng này đã lọt vào vòng ngắm đặc biệt và được nhân nuôi tạo sinh khối tinh sạch phục vụ các nghiên cứu tiếp theo.
 Nhân nuôi in vitro tuyến trùng EPN
Kết quả giám định hình thái và phân tử cho biết đây là loài mới cho khoa học. Đối với các chủng tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic Nematodes- EPN) để luận một loài mới cho khoa học nhóm nghiên cứu phải trải qua nhiều bước gồm: (i) giám định hình thái đánh giá những đặc điểm khác biệt ở các cơ quan sinh sản con đực và con cái; xác định hình thái lượng (morphometrics), đặc biệt ở ấu trùng cảm nhiễm minh chứng các chỉ số hình thái lượng không có sự trùng lắp (overlap) với loài khác. (ii) mặt phân tử cần phân tích 2 đoạn gen là gen ITS-rDNA và D2D3-28S-DNA qua đó khẳng định không những sự khác biệt mà tính đặc thù của 2 gen này cho phép tạo thành một nhánh riêng trên cây phát sinh các loài. (iii) vẫn chưa đủ - để kết luận loài mới cần có thêm một thủ tục là kiểm tra lai chéo – bằng cách cho con đực chủng mới nhốt với con cái của 3-5 chủng gần gũi khác và ngược lại để kết luận loài sinh hoc khi loài mới không thể giao phối với bất kỳ loài đã biết để tạo ra thể hệ mới. Bình thường khi thẩm định xong và đã có kết luận loài mới, nhóm nghiên cứu có thể nhanh chóng công bố loài mới trên tạp chí SCIE, nhưng trong trường hợp này một ý tưởng mới xuất hiện là loài mới cho khoa học lại chứa đựng một tiềm năng sinh học mới (trong việc phòng trừ sâu hại) nên tạm thời chưa công bố loài mới mà sử dụng những cái mới của chủng tuyến trùng để có thể đăng ký một sáng chế. Đây cũng là mô hình đăng ký sáng chế của nhiều nhà khoa học Mỹ với công thức phổ quát là: loài/chủng tuyến trùng mới + khả năng phòng trừ một hoặc một số loài sâu hại = sáng chế mới.
Một loạt thử nghiêm được tiến hành, bao gồm (i) thử nghiệm – bioassays trong điều kiện phòng thí nghiệm để đánh giá độc lực (LC50) của chủng tuyến trùng trên một số sâu hại, trong đó có đối tượng ve sầu hại cà phê; (ii) thử nghiệm trong điều kiện nhà kinh (pot trials) – dùng chậu vại thả ấu trùng ve sầu vào chậu vại chứa đất mô phỏng điều kiện tự nhiên của ruộng cà phê để phun rải ấu trùng cảm nhiễm của tuyến trùng EPN với mật độ khác nhau để đánh giá hiệu lực phòng trừ tối ưu của chủng tuyến trùng.
Không chỉ vậy, để có chế phẩm sinh học tuyến trùng cần nghiên cứu xác định công nghệ thích hợp để nhân nuôi, sản xuất tạo ra chế phẩm. Thực ra về mặt công nghệ nhóm nghiên cứu vẫn duy trì 2 công nghệ nhân nuôi đơn giản là (i) công nghệ in-vivo bằng việc dùng ấu trùng côn trùng sống (thường là ấu trùng bứm sáp lớn - Galleria mellonella) đề làm giá thể nhân nuôi sản xuất tuyến trùng; (ii) công nghệ in-vitro bằng việc tạo môi trường nhân tạo (Chicken Offal) để nhân nuôi, sản xuất tuyến trùng. Trong trường hợp này, nhóm nghiên cứu đã quyết định chọn phương án (ii) để sản xuất chế phẩm sinh học S-PQ16, vì tương đối dễ áp dụng ở quy mô pilot, cho phép nhân nuôi, sản xuất với năng suất và sản lương cao hơn, giá thành khá rẻ.
Đến ve sầu hại cà phê – đối tượng gây hại mới khó diệt
Trong những năm gần đây, ve sầu phát triển mạnh, gây hại nghiêm trọng nhiều vùng sản xuất cà phê thuộc các tỉnh Tây Nguyên làm giảm đáng kể năng suất, sản lượng cà phê. Các chuyên gia đã xác định được 6 loài ve sầu gây hại trên cà phê ở Tây Nguyên, bao gồm ve sầu phấn trắng (Dundubianagarasagna), ve sầu lưng vằn (Haphsa bindusara), ve sầu Đắc Lắc (Poponia daklakensis), ve sầu 4 chấm (Haphsa opercularis), ve sầu nâu đỏ (Purana samia) và ve sầu nhỏ (Purana pigmentata), trong đó loài ve sầu phấn trắng chiếm tỷ lệ cao nhất. Loài ve sầu phấn trắng có thời gian đẻ trứng tương đối dài 35-41 ngày, một ve sầu cái có khả năng đẻ 382-402 trứng và tỷ lệ nở đạt 86-94%. Khi trửng nở, sâu chui xuống đất và sống trong đất, giai đoạn sâu kéo dài từ 275-287 ngày, vòng đời của ve sầu từ 330-333 ngày. Số lượng ấu trùng ve sầu trong đất đạt đỉnh cao vào khoảng từ cuối tháng 4 đến giữa tháng 5, giảm dần từ cuối tháng 5 và lại tăng trở lại vào đầu tháng 9. Sự phát sinh và gây hại của ve sầu bị ảnh hưởng bởi rất nhiều yếu tố như giống, tuổi cây cà phê, cây che bóng, thiên địch, các biện pháp canh tác.
Về mức độ gây hại: ve sầu trưởng thành hút nhựa và đẻ trứng trên các cành nhỏ làm suy kiệt hoặc chết cành, trong khi ấu trùng ve sầu đào hang sống trong đất hút nhựa rễ non làm cây chậm phát triển, còi cọc, lá vàng héo, trái rụng, nếu bị nặng cây có thể chết. Ngoài ra, ve sầu sau khi chích hút đã để lại các vết thương trên rễ, cành cây làm nấm bệnh xâm nhập gây thối rễ, chết cành, nếu nặng thì gây chết cả cây. Như vậy, ve sầu gây hại cho cây cà phê ở tất cả các pha phát triển, nhưng vì các pha ấu trùng sống trong đất có thời gian tồn tại lâu hơn (275-287 ngày so với pha trưởng thành chỉ sống 5-6 tuần) nên chúng gây hại nhiều hơn và là đối tượng để phòng diệt.
Để phòng ngừa ve sầu hại cà phê, người ta đã áp dụng nhiều biện pháp để phòng trừ ve sầu như: (i) dùng nylon phủ kín dưới gốc cà phê vào giai đoạn ve sầu trưởng thành bò lên vũ hóa, bị vướng vào nylon và chết. (ii) đổ nước vôi bột 2% xuồng gốc cây làm cho ấu trùng ve sầu ngoi lên khỏi mặt đất để thu bắt ve sầu làm thức ăn cho gà, hoặc thả gà, vịt để bắt ve sầu. (iii) biện pháp phòng trừ bằng thuốc bảo vệ thực vật, nhưng hầu hết thuốc đều có hiệu quả thấp đối ve sầu hại cà phê. (iv) biện pháp canh tác như bón phân cân đối, không bón thừa đạm, vì đạm sẽ làm rễ và thân cành non mềm dễ bị ve sầu và dịch hại tấn công, dùng loại phân kích thích ra rễ cho cà phê. (v) dùng thiên địch như kiến tiêu diệt trứng và ấu trùng mới nở của ve sầu trước khi chui xuống đất. (vi) dùng keo dính có pha thuốc sâu, quét quanh gốc cà phê để ngăn chặn, bẫy và diệt ấu trùng bò lên cây vũ hóa. (vii) biện pháp sử dụng chế phẩm sinh học nấm Metarhizium anisopliae để phòng trừ ve sầu. Tuy nhiên các biện pháp trên đây đều mang tính thủ công và chỉ có thể hạn một phần mà không phòng trừ triệt để. Do các loại hoá chất bảo vệ thực vật gây ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng tới sức khoẻ cộng đồng nên nhiều nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam đã và đang chuyển sang sử dụng các biện pháp sinh học để phòng trừ sâu bệnh hại. Một trong các biện pháp sinh học có nhiều tiềm năng là sử dụng tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic Nematodes – viết tắt là EPN) để phòng trừ sâu hại.
Chủng tuyến trùng S-PQ16 một ứng viên tiềm năng diệt ve sầu
Trong số hàng trăm nghìn loài tuyến trùng ký sinh ở côn trùng chỉ có một số loài thuộc 2 giống Steinernema và Heterorhabditis là những loài có khả năng vừa ký sinh vừa gây bệnh cho côn trùng, do vậy được gọi là tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic nematodes - EPN). Mặc dù đây là những loài ký sinh bắt buộc ở côn trùng, nhưng chúng lại có một giai đoạn chuyển hóa tồn tại bên ngoài vật chủ côn trùng, thường là môi trường đất. Đó là ấu trùng tuổi 3, còn gọi là ấu trùng xâm nhiễm (infective juveniles-IJ), là giai đoạn đặc biệt trong vòng đời phát triển của nhóm tuyến trùng này. Ở giai đoạn này IJ không cần dinh dưỡng nhưng chúng lại có khả năng tồn tại lâu dài trong môi trường đất khi chưa gặp vật chủ. Thực chất đây là giai đoạn ấu trùng nằm chờ trong đất và sẵn sàng xâm nhập vào vật chủ thích hợp để ký sinh, gây bệnh.
Mỗi IJ mang trong ruột của chúng một loài vi khuẩn cộng sinh (VKCS) chuyển hóa. Đối với các loài tuyến trùng giống Steinernema thì VKCS thuộc giống Xenorhabdus, còn với các loài giống Heterorhabditis thì VKCS thuộc giống Photorhabdus. Ở IJ của các loài Steinernema spp., VKCS nằm trong một cái bọc ở phần trước của ruột, phía sau thực quản. Còn ở IJ của các loài tuyến trùng Heterorhabditis spp. thì VKCS không tập trung trong cái bọc ở phần trước ruột mà chúng nằm rải rác theo chiều dài của ruột, nhưng chủ yếu vẫn là ở nửa trước của ống ruột. Các VKCS này thường có dạng que hoặc dạng ovan dài trông như cái lạp sườn. Kích thước rộng 1-2 mm và dài 3-5 mm, vì vậy có thể quan sát chúng khá rõ dưới kinh hiển vi quang học với độ phóng đại 1500 lần. Bình thường cả lỗ miệng và hậu môn của IJ ở dạng đóng kín, còn VKCS trong ống tiêu hóa của tuyến trùng cũng nằm trong bọc và ở dạng bất hoạt. Sự cộng sinh giữa tuyến trùng và vi khuẩn tạo nên các tổ hợp ký sinh và gây bệnh cho côn trùng (nematode-bacterium). Đây là một hiện tượng cộng sinh bắt buộc, cả tuyến trùng và vi khuẩn không thể sống độc lập với nhau trong tự nhiên.
Khi tìm được vật chủ (sâu hại), ấu trùng cảm nhiễm này sẽ thâm nhập vào xoang máu qua các lỗ mở tự nhiên hoặc trực tiếp qua lớp vỏ kitin mỏng ở khớp chân. Khi vào xoang máu, tuyến trùng sẽ giải phóng vi khuẩn cộng sinh, và vi khuẩn sẽ sinh sôi, tiết protein độc, giết chết vật chủ trong vòng 24 - 48 giờ. Do vậy, những tuyến trùng này được sử dụng làm tác nhân sinh học để sản xuất thuốc sinh học tuyến trùng. Một chu kỳ phát triển của tuyến trùng EPN bắt đầu từ pha ấu trùng cảm nhiễm (tồn tại ở trong đất) đến pha xâm nhập ký sinh và phát triển bên trong cơ thể côn trùng và sau khi kết thúc pha ký sinh và phát triển bên trong xác chết côn trùng, ấu trùng cảm nhiễm (IJs) sẽ phát tán khỏi xác chết côn trùng ra ngoài môi trường đất. Như vậy từ một vài ấu trùng cảm nhiễm sau một chu kỳ ký sinh và phát triển trong côn trùng, tuyến trùng EPN có thể tạo ra hàng trăm ngàn ấu trùng cảm nhiễm mới. Đây là khả năng tái sinh chỉ có ở các loài tuyến trùng EPN.
Thí nghiệm đánh giá hiệu lực gây chết ấu trùng ve sầu của chủng tuyến trùng S-PQ16 được tiến hành ở các nồng độ từ 100 - 600 IJs/sâu, cho kết quả tỷ lệ chết của ve sầu cao nhất đạt 94,4% ở công thức nồng độ 600 IJs. Nồng độ gây chết 50% LC50 = 150 IJs của chủng S-PQ16 là giá trị có thể chấp nhận được đối với đối tượng sâu hại loại “khủng” như ve sầu hại cà phê. Còn khả năng sinh sản của chủng S-PQ16 trên xác chết ve sầu là 66,000±3,900 IJs cũng được coi là khả năng tái sinh vào loại cao. Kết quả thí nghiệm cho thấy cả 3 thông số: Hiệu lực gây chết, độc lực của chủng tuyến trùng được đánh giá qua chỉ số nồng độ gây chết 50% (LC50) và khả năng tái sinh đều đạt tiêu chí của một chủng tuyến trùng tiềm năng đối với ve sầu.
Kết quả thử nghiệm trong chậu vại cũng cho kết quả hiệu lực phòng trừ = 84-88 %; khả năng tái sinh của tuyến trùng trong môi trường đất thử nghiệm đã tăng từ 50, 723 và 810 IJs / 250 mL đất sau 10, 20 và 30 ngày phun rải tuyến trùng cho thấy chủng tuyến trùng S-PQ16 không chỉ có khả năng diệt ấu trùng ve sầu trong điều kiện phòng thí nghiệm mà còn được minh chứng trên mô hình chậu vại, mô phỏng điều kiện đồng ruộng.
Đến việc đăng ký sáng chế
Sáng chế thuộc lĩnh vực bảo vệ thực vật - cụ thể sáng chế đề cập đến phương pháp phòng trừ ve sầu hại cà phê bằng chế phẩm sinh học chứa tuyến trùng Steinernema phuquocense n. sp. S-PQ16. Trong đó, tuyến trùng S-PQ16 này là chủng tuyến trùng mới do Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật phân lập và lưu giữ. Chế phẩm sinh học tuyến trùng S-PQ16 là chế phẩm sinh học đầu tiên diệt được ấu trùng ve sầu hại cà phê - đối tượng gây hại khó diệt nhất tại các trang trại trồng cà phê ở Tây Nguyên. Chế phẩm sinh học tuyến trùng có ý nghĩa kinh tế, xã hội và giúp bảo vệ sức khỏe cộng đồng do không dùng thuốc hóa học độc hại.
Mục đích của sáng chế là khắc phục những nhược điểm nêu trên bằng chủng tuyến trùng mới S-PQ16. Để đạt được mục đích đó, sáng chế đề xuất chế phẩm sinh học phòng trừ ve sầu hại cà phê bằng chủng tuyến trùng mới được ký hiệu là S-PQ16 và được định loại là tuyến trùng mới có tên khoa học là Steinernema phuquocense n. sp. Mã đăng nhập đoạn gen đặc trưng của loài mới tại Ngân hàng Gen quốc tế (GenBank) là KX405172 (vùng ITS-rADN) và KX405173 (vùng 28S). Chế phẩm này có khả năng tiêu diệt ve sầu hại cà phê và một số sâu hại khác. Chế phẩm sinh học tuyến trùng S-PQ16 được tạo ra bằng dung dịch chứa ấu trùng cẩm nhiễm (tuổi 3) của loài và chủng tuyến trùng mới là Steinernema phuquocense n. sp. S-PQ16 với thành phần: + Nước sạch trung tính: 1000 mL (một lít) + Ấu trùng cảm nhiễm: 20.000.000 (hai mươi triệu đơn vị IJ) + Chất phụ gia bôi trơn: 1mL Triton X-100 + Chất phụ gia kháng khuẩn: 1 mL formalin.
Quy trình sản xuất chế phẩm sinh học tuyến trùng phòng trừ ve sầu hại cà phê bao gồm 6 bước cho phép sản xuất chế phẩm sinh học chứa tuyến trùng S-PQ16 để phòng trừ ve sầu hại cà phê với hiệu lực phòng trừ là 84-88%.
Mặc dù đã có ý tưởng từ đầu, đã triển khai các bước thực nghiệm với các phương án khá chặt chẽ trước khi đăng ký sáng chế, nhưng khi thẩm định các chuyên viên của Cục SHTT đã chỉ ra một số điểm được coi là đã “phát lộ” một số yêu cầu bảo hộ để phủ nhận tính mới của sáng chế. Phát lộ đầu tiên có liên quan đến một công bố của nhóm nghiêm cứu trên Tuyển tâp báo cáo Sinh thái và Tài nguyên sinh vật (năm 2015). Phát lộ khác là “quy trình công nghệ để sản xuất thuốc sinh học tuyến trùng là không mới”. Để giải trình rõ 2 vấn đề trên đây GS. Nguyễn Ngọc Châu đã trực tiếp gặp chuyên viên thẩm định để thuyết phục rẳng cả hai vấn đề “phát lộ” nêu trên không hề ảnh hưởng đến tính mới của sáng chế. Vấn đề thứ nhất liên quan đến tên “chủng S-PQ16” khi triển khai thí nghiệm đầu tiên chủng S-PQ16 chỉ là (i) tên mã của chủng tuyến trùng được đặt theo tên viết tắt của giống tuyến trùng (Steinernema) và các ký hiệu viết tắt của địa điểm, tọa độ phân lập chủng tuyến trùng, hoàn toàn khác với tên chủng S-PQ16 sau khi đã được thẩm định về mặt phân loại cũng như tiềm năng sinh học; (ii) thí nghiệm triển khai trên bướm sáp lớn (Galleria mellonella) chứ không liên quan đến ve sầu hại cà phê; (iii) Số liệu thí nghiệm trên bướm sáp lớn không sử dụng trong bản đăng ký sáng chế. Còn công nghệ sản xuất trình bày trong mô tả sáng chế chỉ mang tính “phổ quát”, còn việc áp dụng trong tường trường hợp cụ thể khi sản xuất chế phẩm sinh học mỗi chủng tuyến có những “cải tiến” cụ thể để phù hợp với việc phân lập và nhân nuôi chủng tuyến trùng cũng như chủng vi khuẩn cộng sinh của tuyến trùng – (i) yếu tố này giúp bảo mật sàng chế, người khác dù có tiếp cận với bản mô tả sáng chế cũng khó thực hiên. (ii) yếu tố quan trọng nhất trong sáng chế là chủng tuyến trùng (S-PQ16) sau khi được đánh giá, tuyển chọn và đang được lưu giữ trong nitơ lỏng mà không có nó thì không thể có vật liệu đầu vào để sản xuất chế phẩm sinh học.
Minh Tâm - VAST.
|
Trở lại
In
Số lần xem: 378
|
|
[ Tin tức liên quan ]___________________________________________________
|
