Chỉnh sửa gen cây lúa với công cụ “MLPA” và hệ thống CRISPR-Cas9

Nguồn: S Biswas, R Li, J Hong, X Zhao, Z Yuan, D Zhang, J Shi. 2020. Efective identifcation of CRISPR/Cas9‑induced and naturally occurred mutations in rice using a multiplex ligation‑dependent probe amplifcation‑based method. Theoretical and Applied Genetics August 2020; vol. 133: 2323–2334

Phương pháp dựa trên MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplifcation) được phát triển và sử dụng thành công để tìm thấy những đột biết chủ đích trong hệ thống CRISPR/Cas9 ở hệ gen cây lúa. Hệ thống CRISPR/Cas9 ngày càng được ứng dụng rộng rải trong chỉnh sửa hệ gen cây lúa và cây trồng khác, với chức năng chỉnh sửa có tính chất đa mục tiêu (multiple genomic targets: multiplex) cùng một lúc trên nhiều sinh vật, bao gồm nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu ứng dụng. Sàng lọc di truyền những đột biến chủ đích và không chủ đích qua các mutants từ hệ thống CRISPR/Cas9 ở những thời kỳ rất sớm, phân tích chức năng rồi ứng dụng ngay sau đó. Nhiều phương pháp đã và đang được phát triển để tìm kiếm các đột biến của hệ thống CRISPR/Cas9. Tuy nhiên, còn rất ít kết quả tập trung tìm kiếm cả đột biến chủ đích, không chủ đích ngay cùng một lúc, mà phát hiện riên biệt như những đột biến tự nhiên. Công trình khoa học này ghi nhận kết quả multiplex với phương pháp khả thi cho phép phát hiện đột biến của hệ thống CRISPR/Cas9 biểu hiện chủ đích, không chủ đích cũng như đột biến tự nhiên trên cơ sở multiplex ligation dependent probe amplifcation (MLPA). Không giống những phương pháp khác, phương pháp cải biên của MLPA có thể phân lập một cách chính xác bất cứ INDELs nào phát sinh tự nhiên hoặc phát sinh qua hệ thống CRISPR/Cas9. Nó có thể tìm thấy đột biến tự nhiên và hợp tử (zygosity) của những đột biến CRISPR/Cas9-trong cây lúa. Hơn nữa, độ nhạy của nó cho phép tìm thấy những INDELs tới mức 1 bp và tìm thấy đoạn thay thế (substitutions) tới mức một nucleotide. Do vậy, phương pháp MLPA rất nhạy, đáng tin cậy, rẻ tiền, giúp cho nghiên cứu genome học chức năng rất thuận lợi, cũng như chọn giống nhờ chỉ thị phân tử cho cây trồng, trong đó có cây lúa.

Xem https://link.springer.com/article/10.1007/s00122-020-03600-5

Tìm đột biến có chủ đích bằng phương pháp MLPA.

Giải trình tự lúa cỏ với đặc điểm võ trấu đen, có râu

Nguồn: Md. Shofiqul Islam, Sapphire Coronejo & Prasanta Kumar Subudhi. 2020. Whole-genome sequencing reveals uniqueness of black-hulled and straw-hulled weedy rice genomes. Theoretical and Applied Genetics August 2020; 133: 2461–2475

So sánh kiểu hình CPRS, PSRR, và BHA. (a) So sánh tỷ lệ nẩy mầm của hạt vừa thu hoạch còn tươi ở 7 ngày, 28°C. (b) bông lúa biểu hiện rụng hạt, (c) tính trạng râu hạt, (d) màu gạo lứt giữa CPRS, PSRR, và BHA.

Cả kiểu gen lúa cỏ thuộc SH và BHA đều tiến hóa một cách độc lập, có thành phần hệ gen khác biệt nhau. Những cơ chế di truyền khác nhau có thể tương ứng với bản chất cạnh tranh (competitiveness) và bản chất thích nghi (adaptation) với ngoại cảnh. Hai loại hình chính của lúa cỏ được phân biệt tại Hoa Kỳ là (trên cơ sở hình thái học): SH (straw-hull: võ trấu màu vàng rơm) và BHA (black-hull awned: võ trấu đen có râu). Người ta thực hiện kỹ thuật  whole-genome resequencing của loại hình lúa cỏ SH có tên là ‘PSRR-1’, loại hình lúa cỏ BHA có tên là ‘BHA1115’, giống lúa loại hình japonica có tên là ‘Cypress’ để làm rõ sự khác biệt ở mức độ genome-wide và để làm rõ bản chất di truyền cũng như bản chất tiến hóa của lúa cỏ. Phương pháp đọc (reads) chất lượng cao ghi nhận phủ được 82–88% hệ gen (genome coverage). Số chỉ thị phân tử SNPs chuyên biệt cho genome cũng như số chỉ thị InDels đạt mức cao nhất trong giống lúa Cypress, theo sau là mẫu giống BHA1115 và PSRR-1. Tuy nhiên, nhiều gen bị ảnh hưởng trong mẫu giống BHA1115 so với 2 mẫu giống nói trên, điều này minh chứng số chỉ thị phân tử SNPs và InDels có tác động lớn. Phân tích haplotype của những gen chọn lọc liên quan đến sự thuần hóa, sự thích nghi, sự hoàn thiện tính trạng nông học không chỉ khác biệt trong mẫu giống lúa cỏ SH với mẫu BHA - làm cho sự tiến hóa của lúa cỏ diễn ra qua sự kiện phản lại quá trình thuần hóa (de-domestication), mà còn  làm rõ được chức năng của nhiều gen quan trọng như qAn-1, qAn-2, Bh4, Rc, SD1, OsLG1, và OsC1. Nhiều gen (QTLs) ứng cử viên đã được xác định đối với tính ngủ nghỉ của hạt (dormancy) và tính trạng dễ rụng hạt (shattering). Lúa cỏ loại hình SH và BHA có thành phần hệ gen rất khác biệt nhau (distinct genomic composition), lúa cỏ loại hình BHA dường như đa dạng hơn loại hình SH. Quy tụ các gen có liên quan đến phát triển sinh thực, sinh dục và hệ thống tự vệ, trong hệ gen lúa cỏ giúp sẽ giúp chúng cạnh tranh sinh tồn rất giỏi và lan rộng rất nhanh, trong điều kiện ngoại cảnh vô cùng thay đổi, bởi cơ chế di truyền mới và năng động của chúng. Nguồn gen này tỏ ra hữu ích cho cả nội dung quản lý cỏ dại và nội dung cải tiến giống lúa, trên cơ sở khai thác kết quả này ở mức độ phân tử đối với những tính trạng nông học chính, tính thích nghi, và tính thuần hóa.

Xem https://link.springer.com/article/10.1007/s00122-020-03611-2

Di truyền tính kháng bệnh đốm lá cây bắp (Cercospora zeae-maydis)

Nguồn: Lei Du, Feng Yu, Hao Zhang, Bo Wang, Kejun Ma, Changping Yu, Wangsen Xin, Xing Huang, Yongzhong Liu & Kede Liu. 2020. Genetic mapping of quantitative trait loci and a major locus for resistance to grey leaf spot in maize. Theoretical and Applied Genetics August 2020, 133:2521–2533

Cơ sở di truyền tính kháng bệnh GLS được thực hiện thông qua quần thể đơn bội kép (DH) chia sẻ tính kháng từ một bố mẹ. Người ta tìm thấy 1 QTL trong nhiều giai đoạn phát triển khác nhau, nhiều địa điểm thí nghiệm khác nhau. Nó được fine mapped trong một quần thể con lai hồi giao. Bệnh đốm lá bắp (grey leaf spot: GLS), do nấm Cercospora zeae-maydis hoặc Cercospora zeina, làm tổn thương rất nặng hệ thống phiến lá của các vùng trồng bắp trên thế giới. Cơ chế di truyền tính kháng GLS vẫn chưa được hiểu nhiều. Nghiên cứu di truyền tính kháng bệnh được thực hiện trên hai quần thể con lai DH (đơn bội kép: doubled haploid) chia sẻ tính kháng từ một bố mẹ. Hai quần thể DH này được trồng tại 2 địa điểm khác nhau, biểu thị cho vùng trồng bắp trên đồi núi điển hình ở tây nam Trung Quốc liên tục 2 năm. Mức độ bệnh GLS được nghiên cứu đánh giá 2 hoặc 3 lần cho đến khi chín trong 2 năm, vùng trồng với diễn biện dịch bệnh được theo dõi trên biểu đồ, suốt năm. Hai bản đồ di truyền dạng linkage maps, độ phân giải cao, được thực hiện theo phương pháp GBS (genotyping-by-sequencing). Có 22 quantitative trait loci (QTLs) được tìm thấy, điều khiển tính kháng bệnh GLS, hầu hết QTLs được thấy có tính chất lập lại ở nhiều giai đoạn khác nhau, ở các địa điểm khác nhau, ở năm khác nhau. Quan sát confidence intervals của hai QTL chủ lực ấy (qGLS_Y2-2 và qGLS_Z2-1) định vị trên NST 2, từ hai quần thể DH nói trên, bao trùm lẫn nhau và hợp nhất lại thành một consensus QTL, đó là qGLS_YZ2-1. Sử dụng cây kháng cao và cây nhiễm nặng từ quần thể hồi giao BC₃ , người ta thực hiện fine mapped tại locus này để xác định vùng đích có độ lớn phân tử là 2.4 Mb. Sử dụng một panel bao gồm 255 dòng tự phối (cận giao)  của các chương trình lai, người ta tìm thấy pnhững phối hợp giữa chỉ thị phân tử trong vùng chứa qGLS_YZ2-1 rvà tìm thấy tính kháng bệnh GLS. Chỉ thị phân tử được gọi là peak marker (ID-B1) sẽ rất hữu ích trong chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) để có giống bắp kháng bệnh GLS.

Xem https://link.springer.com/article/10.1007/s00122-020-03614-z

Di truyền tính kháng bệnh virus vàng xoăn lá

Nguồn: Garnelo Gómez B, D Zhang, T Rosas-Díaz, Y Wei, AP Macho and R Lozano-Durán. 2019. The C4 Protein from Tomato Yellow Leaf Curl Virus Can Broadly Interact with Plant Receptor-Like Kinases. Viruses 11:1009-1022

TYLCV gây thiệt hại nghiêm trọng cho vùng sản xuất cà chua trên toàn thế giới, đặc biệt ở nhiệt đới và cận nhiệt đới. Virus này được truyền đi do  côn trùng thuộc họ Aleyrodidae, bộ Hemiptera, đó là bọ phấn trắng (tiếng Anh: whitefly, tên khoa học Bemisia tabaci).  Ký chủ chính của siêu vi TYLCV là cây cà chua, những ký chủ khác còn có: cà tím, khoai tây, thuốc lá, đậu cô ve, và ớt. Dịch bệnh siêu vi này phát triển rất nhanh trong vài thập niên gần đây trên các vùng sản xuất cà chua của thế giới, do đó, người ta tập trung nghiên cứu giống kháng để quản lý bệnh này. TYLCV truyền bệnh một cách transovarially cho thế hệ con lai đến hai thế hệ. Phân tử RLKs của cây (receptor-like kinases) có chức năng vô cùng quan trọng trong sự truyền tín hiệu phân tử từ bên ngoài tế bào vào tế bào chất và nhiễm sắc thể trong nhân, hoạt động như những regulators cần thiết để cây phát triển và phản ứng với stress do ngoại cảnh tác động. Người ta còn thấy rằng phân tử RLKs có vai trò quan trọng trong tương tác giữa cây trồng và virus, cho dù những chi tiết và tính đa dạng của các ảnh hưởng, cũng như cơ chế phân tử còn đang nghiên cứu. Protein C4 của nhiều geminiviruses đã được phát hiện có khả năng tương tác với RLKs trong clade CLAVATA 1 (CLV1). Tuy nhiên, C4 có thể tương tác với RLKs trong những họ phụ (subfamilies) khác nữa, tác động sinh học nào trong mối tương tác ấy vẫn còn là câu hỏi lớn cần phải nghiên cứu. Công trình khoa học này đã khai thác tính chất tương tác như vậy của protein C4 từ loài geminivirus gây bệnh vàng xoăn lá cà chua (tomato yellow leaf curl) theo họ RLK của cây Arabidopsis. Kết quả cho thấy protein C4 có khả năng tương tác với RLKs của những subfamilies khác nhau, không giới hạn, tất cả mọi thành viên của clade CLV1. Phân tích chức năng sinh học phân tử của tương tác giữa C4 với hai phân tử RLKs được định tính rõ ràng, FLAGELLIN SENSING 2 (FLS2) và BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1 (BRI1), chỉ ra rằng protein C4 có khả năng ảnh hưởng nhiều hơn, nhưng không phải tất cả, những kết quả do RLK dẫn đến. Như vậy nghiên cứu này cho thấy một nhận thức mới về tương tác trong quá trình truyền tín hiệu của RLK và sự lây nhiễm của geminiviruses. Protein C4 là một manipulator phổ rộng của hệ thống truyền tín hiệu RLK.

Xem https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31683645/

Họ protein LecRLKs của hệ gen khoai tây (Solanum tuberosum) kháng Phytophthora

Nguồn: W Zhang, Z Chen, Y Kang, Y Fan, Y Liu, X Yang, M Shi, K Yao, S Qin. 2020. Genome-wide analysis of lectin receptor-like kinases family from potato ( Solanum tuberosum L.). Peer J. 2020 Jun 10;8:e9310.  doi: 10.7717/peerj.9310. eCollection 2020.

Lectin receptor-like kinases (LecRLKs) là họ protein có trong phản ứng của cây khoai tây với môi trường bất thuận, stress phi sinh học, stress sinh học là bệnh do vi sinh vật gây ra. Họ protein này trong genome cây khoai tây (Solanum tuberosum) rất lớn nhưng chưa được nghiên cứu nhiều. Tổng cộng có 113 thành viên LecRLKs (StLecRLKs) trong khoai tây đã được phân lập lần đầu tiên, bao gồm 85 thành viên G-type, 26 L-type và 2 C-type. Trên cơ sở phân tích di truyền huyết thống (phylogenetic analysis), StLecRLKs được chia vào nhóm phụ với 7 clades, đó là C-type, L-type, G-I, G-II, G-III G-IV và G-V. Sự phân bố gen mã hóa protein này trên  nhiễm sắc thể và kết quả phân tích duplication cho kết quả rằng: sự lan rộng của StLecRLKs diễn ra chủ yếu thông qua sự kiện tandem duplication (luân phiên lập đoạn) thay vì sự kiện WGD (whole-genome duplication: lặp đoạn toàn hệ gen) hay sự kiện segmental duplication (lặp đoạn ở mức độ đoạn phân tử). Những Cis-elements trong các promoter của StLecRLKs  chủ yếu phản ứng với các tín hiệu để cây tự vệ và cây phản ứng với stress, phytohormone. Hơn nữa, nghiên cứu biểu hiện gen cho thấy các thành viên của họ thuộc những clades: L-type, G-I, G-IV và G-V, rất nhạy với sự xâm nhiễm của vi khẩun và nấm gây bệnh. Kết quả phân tích qRT-PCR cho thấy: sự biểu hiện gen PGSC0003DMP400055136 và PGSC0003DMP400067047 được kích thích rất mạnh mẽ bởi nghiệm thức xử lý chủng Fusarium sulphureum (Fs) và Phytophthora infestans (Pi).

Xem https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32566405/

Phân bố các gen LecRLKs trên nhiễm sắc thể khoai tây (Solanum tuberosum); Khoảng cách: Mb.