Nguyễn Ngọc Tấn[1], Nguyễn Văn Phú¹, Trần Văn Trưng¹

1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ nửa sau của thế kỷ 20 cho đến nay, đã có nhiều tiến bộ trong việc nghiên cứu sử dụng phôi trong điều kiện in vitro cho việc cải tiến di truyền và/hoặc cho các mục đích nghiên cứu khác. Tuy nhiên chất lượng phôi thu được trong điều kiện in vitro thấp hơn một cách đáng kể so với điều kiện in vivo. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng có sự khác nhau giữa phôi thu được từ nguồn in vivo và in vitro về hình dáng phôi (Van Soom và ctv., 2003), trao đổi chất (Khurana and Niemann, 2000), sự bất thường của nhiễm sắc thể  (Viuff và ctv., 1999), năng suất và chất lượng phôi (Knijn và ctv., 2003), sức chịu đựng khi đông lạnh phôi (Rizos và ctv., 2003), chỉ số chết của tế bào (Kim và ctv., 2006) cũng như sự biểu hiện của các gen liên quan đến phát triển của phôi (Wrenzycki và ctv., 2005). Những khác biệt trên là do sự khác biệt về môi trường nuôi thành thục tế bào trứng và phôi trong điều kiện in vitro so với in vivo. Mặc dù môi trường nuôi giai đoạn nuôi phôi đóng vai trò rất quan trọng do nó ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và chất lượng phôi nhưng không thể bỏ qua tầm quan trọng của việc nuôi thành thục tế bào trứng (Lonergan và ctv., 2003). Nhiều nghiên cứu cho thấy sử dụng dịch nang noãn để bổ sung vào môi trường nuôi tế bào trứng làm gia tăng sự thành thục về nhân cũng như tế bào chất, hoặc sử dụng huyết thanh bê bổ sung vào môi trường nuôi phôi làm gia tăng hiệu quả phát triển phôi. Tuy nhiên, một hạn chế đó là còn nhiều yếu tố chưa biết tồn tại trong dịch nang noãn hay huyết thanh bê có thể tác động cộng hưởng với các hoạt chất trong môi trường nuôi in vitro gây nên những ảnh hưởng mà chúng ta không rõ cơ chế. Cho nên việc nghiên cứu sử dụng các yếu tố tăng trưởng được quan tâm nhiều trong thời gian qua nhằm hiểu rõ hơn vai trò của các yếu tố tăng trưởng có trong môi trường in vivo và qua đó tối ưu hóa môi trường nuôi in vitro sao cho gần tương đồng với điều kiện in vivo. Sử dụng insulin-like growth factor I trong môi trường nuôi phôi đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu trong thời gian qua nhưng chưa có nhiều nghiên cứu về ảnh hưởng của IGF-1 trong môi trưởng nuôi thành thục tế bào trứng đến sự thành thục tế bào trứng (kể cả nhân và tế bào chất) và sự phát triển của phôi giai đoạn sau đó. Vì thế, nghiên cứu này được tiến hành nhằm đánh giá ảnh hưởng của IGF-1 đến sự thành thục về nhân của tế bào trứng và phát triển phôi bò đến giai đoạn phôi nang trong điều kiện in vitro.

2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu, hóa chất và địa điểm nghiên cứu

• Hóa chất: hóa chất sử dụng được mua từ công ty Sigma Aldrich.
• Vật liệu: buồng trứng bò thu nhận từ các lò mổ địa phương tại Tân Uyên (Bình Dương) và đức Hòa (Long an).
• Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học của Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam từ tháng 1 đến tháng 6 năm 2012.

2.2. Thu nhận buồng trứng, chọc hút tế bào trứng và nuôi thành thục tế bào trứng

• Buồng trứng được thu nhận và bảo quản trong dung dịch nước muối sinh lý (có bổ sung 300 000 IU penicillin) và giữ ấm ở nhiệt độ 35 ^oC. Sau khi đưa về phòng thí nghiệm, buồng trứng được rửa sạch 03 lần bằng dung dịch nước muối sinh lý. Sau đó, tế bào trứng được chọc hút từ các nang noãn có đường kính từ 2-8 mm bằng syringe 10 mL gắn với kim 18.
• Những tế bào trứng có ít nhất 2 lớp tế bào cumulus (COCs) và đồng nhất vế tế bào chất (Hình 1A) được chọn lựa để nuôi thành thục, tế bào được chọn lựa tiếp tục rửa qua dung dịch nuôi thành thục tế bào trứng 3 lần, sau đó chuyển vào nuôi trong vi giọt 100 µL (20-25 tế bào trứng/giọt) được phủ bởi dầu khoáng và cân bằng nhiệt trước đó. Thời gian nuôi 22-24 giờ trong tủ ấm 38,5 ^oC, 5% CO₂ và bão hòa hơi nước.
• Môi trường nuôi thành thục tế bào trứng là TCM-199 (Tissue Culture Medium) bổ sung FSH (Follicle-Stimulating hormone): 10 IU/mL, hCG (human Chorionic Gonadotropin): 20 IU/mL và Estradiol 17-β: 1µg /mL. Nguồn protein sử dụng là 5% FCS (Fetal Cafl Serum) hoặc 5 mg/mL BSA tùy theo thiết kế thí nghiệm.

2.3. Thụ tinh in vitro và nuôi phôi

• Tinh trùng đông lạnh được giải đông và dội rửa (ly tâm ở 2000 rpm trong 5 phút) 02 lần bằng dung dịch BO (Brackett-Oliphant) có bổ sung 5% FCS, caffeine (3,84 mg/mL) và heparin (5000 U/mL). Sau đó pha loãng bằng môi trường BO bổ sung BSA (4 mg/mL) để điều chỉnh nồng độ tinh trùng khoảng 12 Ð 10⁶ tinh trùng/mL.
• Sau khi nuôi thành thục tế bào trứng 22 giờ, tế bào trứng (chưa loại bỏ tế bào cumulus) được dội rửa 3 lần bằng dung dịch BO có bổ sung 1 mg/mL BSA và chuyển vào vi giọt thụ tinh có dung tích 45 µL/giọt. Môi trường sử dụng cho thụ tinh in vitro là BO bổ sung BSA (4 mg/mL).
• Hút 45 µL dung dịch tinh trùng và bơm vào vi giọt đã có sẵn tế bào trứng để đạt nồng độ tinh trùng cuối cùng là 6 Ð 10⁶ tinh trùng/mL. Đưa vào tủ ấm (38,5 ^oC, 5% CO₂ và bão hòa hơi nước), thời gian đồng nuôi cấy tinh trùng và tế bào trứng khoảng 8 - 10 giờ.
• Sau thời gian đồng nuôi cấy, phôi bào giả định (presumptive zygote) được loại bỏ hoàn toàn tế bào cumulus bằng men hyaluronidase. Chọn những phôi bào giả định có thể cực thứ nhất để tiếp tục nuôi trong thời gian 7 ngày bằng dung dịch nuôi phôi là CR1aa (Charles Rosenkrans 1) hoặc TCM-199 tùy theo thiết kế thí nghiệm.

2.4. Nội dung và thiết kế thí nghiệm:

2.4.1. Thí nghiệm 1. Ảnh hưởng của nguồn protein khác nhau đến sự thành thục về nhân tế bào trứng bò.

Tỷ lệ tế bào trứng thành thục về nhân được tính bằng tổng số tế bào trứng có thể cực thứ nhất chia cho tổng số tế trứng đưa vào nuôi thành thục và nhân cho 100.

2.4.2. Thí nghiệm 2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi phôi khác nhau đến sự phát triển phôi bò in vitro

Sau khi thụ tinh 8-10 giờ, các phôi bào giả định có thể cực thứ nhất tiếp tục được nuôi trong môi trường TCM-199 hoặc CR1aa với thời gian 7 ngày (168 giờ). Đánh giá sự phân chia tế bào lúc 48 giờ sau khi thụ tinh và phôi dâu/phôi nang được đánh giá vào ngày thứ 7 sau khi thụ tinh bằng kính hiển vi soi nổi thông thường.Tỷ lệ phôi hai tế bào được tính bằng tổng số phôi có ít 2 tế bào lúc 48 giờ sau thụ tinh chia cho tổng số tế bào thành thục nhân và nhân cho 100. Tỷ lệ phôi dâu/nang ngày thứ 7 bằng tổng số phôi dâu/nang ở thời điểm 168 giờ sau khi thụ tinh chia cho tổng số tế bào thành thục về nhân và nhân cho 100.

2.4.3. Thí nghiệm 3. Ảnh hưởng của hàm lượng IGF-1 khác nhau đến sự thành thục nhân tế bào trứng bò in vitro

Môi trường nuôi thành thục tế bào trứng là TCM-199+5% FCS được bổ sung IGF-1 với các nồng độ khác nhau (0, 50, 100 và 200 ng/mL) và môi trường nuôi phôi là CR1aa được chọn ra từ Thí nghiệm 2. Qúa trình nuôi thành thục tế bào trứng, nuôi phôi và đánh giá các chỉ tiêu theo dỏi như Thí nghiệm 1 và 2.

2.5 Xử lý số liệu

Số liệu được xử lý bằng phần mềm SAS 9.1 theo ANOVA bằng mô hình tuyến tính tổng quát GLM (general linear model). So sánh sự sai khác giữa các nghiệm thức bằng trắc nghiệm Tukey với P<0,05. Tỷ lệ phần trăm được chuyển về arsine trước khi đưa vào xử lý thống kê.

3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Thí nghiệm 1. Ảnh hưởng của nguồn protein khác nhau đến sự thành thục về nhân tế bào trứng bò

Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nguồn protein khác nhau bổ sung vào môi trường nuôi thành thục tế bào trứng được trình bày ở Bảng 1.

Bảng 1. Ảnh hưởng của nguồn protein khác nhau đến sự thành thục về nhân tế bào trứng bò

Số liệu trong ngoặc là Xtb±SE; Thí nghiệm lặp lại 3 lần

Các số trong một cột tận cùng bằng một chữ không khác biệt có ý nghĩa ở mức P<0,05

Kết quả ở Bảng 1 cho thấy việc sử dụng FCS hoặc BSA không ảnh hưởng đến sự thành thục về nhân của tế bào trứng (77,2 so với 73,2%; P > 0.05). Tuy nhiên, bổ sung FCS làm giảm đáng kể tỷ lệ tế bào trứng thoái hóa trong quá trình nuôi thành thục tế bào trứng so với việc bổ sung BSA (6,0 so với 13,7%; P < 0.05). Hamman và ctv (2010) cho thấy tỷ lệ thành thục nhân tế bào trứng trâu cao hơn có ý nghĩa (75% so với 68%; P<0,05) khi sử dụng môi trường TCM-199 có bổ sung FBS (Fetal Bovine Serum) so với bổ sung BSA nhưng không có sự sai khác có ý nghĩa giữa hai loại môi trường cơ bản (TCM-199 hoặc Ham’s F10) được sử dụng để nuôi thành thục tế bào trứng trâu. Điều này cũng cho thấy rằng FCS hoặc FBS còn chứa đựng nhiều yếu tố chưa biết (unknown factors) mà chính những yếu tố này giúp cải thiện hiệu quả nuôi thành thục tế bào trứng in vitro trong môi trường xác định rõ thành phần (defined medium). Trong khi đó theo Farrin và ctv. (2001) cho biết BSA tác dụng như là nguồn cung cấp protein, có thể được gắn kết với hormone chứa trong môi trường đó và vì thế BSA được quan tâm sử dụng cho môi trường định rõ bán thành phần (semi-defined medium).

3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của môi trường nuôi phôi khác nhau đến sự phát triển phôi bò in vitro

Kết quả đánh giá sự phát triển của phôi nuôi trong các môi trường khác nhau được tổng hợp và trình bày ở Bảng 2.

Bảng 2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi phôi khác nhau đến sự phát triển phôi bò

Số liệu trong ngoặc là Xtb±SE; Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Các số trong một cột tận cùng bằng một chữ không khác biệt nghĩa ở mức P<0,05

Kết quả ở Bảng 2 cho thấy tỷ lệ phôi hai tế bào cao hơn có ý nghĩa (P<0,05) khi sử dụng môi trường CR1aa để nuôi phôi so với môi trường TCM-199 (74,5% so với 61,6%). Tương tự, tỷ lệ phôi nang ở ngày thứ 7 cũng cao hơn ở môi trường CR1aa so với TCM-199 (9,1% so với 5,1%; P<0,05). Kết quả cũng cho thấy hai môi trường nuôi phôi khác nhau không có ảnh hưởng đến tỷ lệ phôi dâu ( P> 0,05). Yohan và Arief (2008) cũng cho thấy kết quả tương tự khi sử dụng môi trường TCM-199 và CR1aa để nuôi thành thục tế bào trứng và phôi dê in vitro. Hiệu quả vượt trội của môi trường CR1aa trong việc nuôi phôi có lẽ do nguồn cung năng lượng cho sự phát triển phôi khác nhau từ hai loại môi trường sử dụng. Theo chúng tôi, nguồn năng lượng từ pyruvate và lactate ở môi trường CR1aa tỏ ra có ích cho sự phát triển của phôi trong giai đoạn trước phôi dâu so với nguồn năng lượng là glucose trong môi trường TCM-199. Chính vì thế, môi trường CR1aa thúc đẩy nhanh hơn sự phân chia ở giai đoạn 2 tế bào so với môi trường TCM-199. Mặt khác, theo Bavester và ctv. (1992) hàm lượng cao hơn của glutamine trong môi trường CR1aa đóng vai trò quan trọng để phôi phát triển ở giai đoạn phôi dâu và phôi nang.

3.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của hàm lượng IGF-1 khác nhau đến sự thành thục nhân tế bào trứng bò in vitro

Khi bổ sung IGF-1 vào môi trường nuôi thành thục tế bào trứng ở các nồng độ khác nhau (0, 50, 100 và 200 ng/mL), kết quả đánh giá sự thành thục về nhân tế bào trứng được trình bày ở Bảng 3.

Bảng 3. Ảnh hưởng của các nồng độ IGF-1 khác nhau đến sự thành thục nhân tế bào trứng và phát triển phôi bò đến giai đoạn phôi nang

*: IGF-1 chỉ bổ sung vào môi trường nuôi thành thục tế bào trứng. Số liệu trong ngoặc là Xtb±SE; Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Các số trong một cột tận cùng bằng một chữ không khác biệt có ý nghĩa ở mức P<0,05

Kết quả ở Bảng 3 cho thấy khi gia tăng nồng độ IGF-1 từ 50 đến 100 ng/mL làm gia tăng tỷ lệ số tế bào đạt đến thành thục về nhân so với đối chứng (tương ứng 79,5 và 86,7% so với 73,6%; P<0,05). Tuy nhiên, khi gia tăng nồng độ IGF-1 đến 200 ng/mL không có ảnh hưởng đến sự thành thục về nhân tế bào trứng bò (75%) so với đối chứng hoặc so với nồng độ 50 ng/mL (P>0,05). Hầu hết các nghiên cứu trước đó tập trung vào việc đánh giá hiệu quả bổ sung IGF-1 trong môi trường nuôi phôi đến phát triển phôi và đây là nghiên cứu đầu tiên sử dụng IGF-1 trong môi trường nuôi thành thục tế bào trứng để đánh giá hiệu quả thành thục nhân tế bào.

Wasielak và Bogacki (2007) cho thấy khi bổ sung IGF-1 trong môi trường nuôi thành thục tế bào trứng bò làm giảm apoptosis (bằng kỹ thuật TUNEL) nhưng không có đánh giá về tác dụng của IGF-1 đến sự thành thục tế bào. Trong khi đó các nghiên cứu trên phôi cho thấy bổ sung IGF-1(100 ng/mL) làm tăng tỷ lệ phôi nang, giảm sự chết tế bào – apoptosis (Kim và ctv., 2006; Velazquez và ctv., 2011), làm tăng số tế bào trên phôi nang thông qua con đường mitogen-activated protein kinase trên phôi bò (Bonilla và ctv., 2011).

Bên cạnh đó, để đánh giá khả năng phát triển của phôi từ tế bào trứng nuôi thành thục trong môi được bổ sung nồng độ khác nhau của IGF-1, sau khi thụ tinh các tế bào thành thục về nhân tiếp tục được nuôi trong môi trường nuôi phôi trong thời gian 7 ngày. Kết quả cho thấy tỷ lệ phôi 2 tế bào gia tăng ở nhóm tế bào trứng nuôi thành thục có bổ sung 50 và 100 ng/mL IGF-1(81,5% và 88,2%) so với không bổ sung (72,3%) hoặc bổ sung ở nồng độ 200 ng/mL (76,5%). Tuy nhiên, sự sai khác chỉ có ý nghĩa thống kế (P<0,05) ở nhóm bổ sung IGF-1 ở mức 100 ng/mL so với nhóm đối chứng và nhóm bổ sung ở mức 200 ng/mL. Tỷ lệ  phôi nang đạt cao nhất (P<0,05) ở nhóm tế bào trứng được nuôi thành thục trong môi trường có bổ sung 100 ng/mL IGF-1 (16,9%) so với đối chứng (10,1%) hoặc có bổ sung IGF-1 nồng độ thấp 50 ng/mL (11,2%) và nồng độ cao 200 ng/mL (9,7%). Tổng hợp kết quả cho thấy bổ sung IGF-1 với liều 100 ng/mL không những giúp cải thiện hiệu quả nuôi thành thục nhân tế bào mà còn có ảnh hưởng tích cực đến sự phát triển của phôi sau đó. Theo chúng tôi, điều này có thể do ảnh hưởng có lợi của việc bổ sung IGF-1 đến sự thành thục tế bào chất và chính sự thành thục tế bào chất mang lại hiệu quả tích cực cho sự phát triển của phôi đến giai đoạn phôi nang. Tuy nhiên, điều này cần được nghiên cứu làm rõ ở những nghiên cứu tiếp theo. Mặt khác, kết quả cũng cho thấy bổ sung IGF-1 trong môi trường nuôi thành thục tế bào trứng không có ảnh hưởng đến tỷ lệ phôi nang.

4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

TCM-199 có bổ sung 5% FCS và CR1aa là môi trường thích hợp tương ứng cho nuôi thành thục tế bào trứng và phôi trong điều kiện in vitro. Bổ sung IGF-1 với nồng độ 100 ng/mL trong môi trường nuôi thành thục tế bào trứng có tác dụng làm gia tăng sự thành thục nhân tế bào trứng và sự phát triển của phôi bò đến giai đoạn phôi nang. Tuy nhiên những cơ chế, ảnh hưởng của IGF-1 trong môi trường nuôi thành thục tế bào trứng đến sự phát triển phôi sau đó cần được làm sáng tỏ nhiều hơn. Bên cạnh đó, cần tiếp tục cải thiện hơn nữa hiệu quả của hệ thống nuôi cấy (culture system) nhằm tăng hiệu quả sản xuất phôi in vitro.

Tài liệu tham khảo

Bonilla AQ, Ozawa M, Hansen PJ. 2007. Timing and dependence upon mitogen-activated protein kinase signaling for pro-developmental actions of insulin-like growth factor 1 on the preimplantation bovine embryo. Growth Horm IGF Res., 21(2):107-111.

Hamman AM, Whisnant CS, Elias A, Zaabel SM, Hegab AO, and Abu- El Naga EM. 2010. Effect of media, sera and hormone on in vitro maturation and fertilization of water buffalo (Bubalus bubalis). J. Anim. Vet. Adv. 9: 27-31.

Khurana NK, Niemann H. 2000. Energy metabolism in preimplantation bovine embryos derived in vitro or in vivo. Biol Reprod 62:847-856.

Kim S, Lee SH, Kim JH, Jeong YW, Hashem MA, Koo OJ, Park SM, Lee EG, Hossein MS, Kang SK, Lee BC, Hwang WS. 2006. Anti-apoptotic effect of insulin-like growth factor (IGF)-I and its receptor in porcine preimplantation embryos derived from in vitro fertilization and somatic cell nuclear transfer. Mol Reprod Dev.,73(12):1523-1530.

Knijn HM, Gjorret JO, Vos PLAM, Hendriksen PJM, van der Weijden BC, Maddox-Hyttel P, Dieleman SJ. 2003. Consequences of in vivo development and subsequent culture on apoptosis, cell number, and blastocyst formation in bovine embryos. Biol Reprod 69:1371-1378.

Lonergan, P., Rizos, D., Gutierrez-Adan, A., Fair, T., and Boland, M. O.2003. Oocyte and embryo quality: effect of origin, culture conditionsand gene expression patterns. Reprod. Domest. Anim. 38, 259–267

Rizos D, Gutierrez-Adan A, Perez-Garnelo S, de la Fuente J, Boland MP, Lonergan P. 2003. Bovine embryo culture in the presence or absence of serum: Implications for blastocyst development, cryotolerance, andmessenger RNA expression. Biol Reprod 68:236–243

Van Soom A, Mateusen B, Leroy J, de Kruif A. 2003. Assessment of mammalian embryo quality: What can we learn from embryo morphology? Reprod BioMed Online 7:664–670.

Velazquez M A, Hermann D, Kues WA, Niemann H. 2011. Increased apoptosis in bovine blastocysts exposed to high levels of IGF1 is not associated with downregulation of the IGF1 receptor. Reproduction 141 91–103

Viuff D, ReckordsL,Offenberg H, Hyttel P, Avery B, GreveT,Olsaker I, Williams JL, Callesen H, Thomsen PD. 1999. A high proportion of bovine blastocysts produced in vitro are mixoploid. Biol Reprod 60:1273-1278

Wasielak M và Bogacki M. 2007. Apoptosis inhibition by insulin-like growth factor I during in vitro maturation of bovine oocyte. J. Reprod. Dev. 53:419-426.

Wrenzycki C, Herrmann D, Lucas-Hahn A, Korsawe K, Lemme E, Niemann H. 2005. Messenger RNA expression patterns in bovine embryos derived from in vitro procedures and their implications for development. Reprod Fertil Dev 17:23–35.